離子交換纖維素在實驗室中的用法

1、Whatman離子交換纖維素在實驗室中的用法有關(guān)如何使得介質(zhì)獲得最佳結(jié)果達到最佳分離結(jié)果Whatman公司已為蛋白質(zhì)、酶和核酸片斷等生物多聚物的有效分離特別開發(fā)了一系列Whatman離子交換纖維素。在使用時只有確切的按注意事項操作才能得到最佳分離效果。介質(zhì)種類 類型干品預(yù)溶脹 陰離子交換 陽離子交換 物理形態(tài) 纖維狀 微粒狀微粒狀全離子化微粒 比52型結(jié)合力較弱的微粒狀 比52型結(jié)合力較弱的微粒狀比52型結(jié)合力強的全離子化微粒交換劑的預(yù)處理1 預(yù)溶脹（51，52和53）型離子交換劑不用預(yù)先反復處理就可使用。但必須用緩沖鹽充分平衡。預(yù)溶脹的離子交換劑在每次預(yù)處理或再生后使用不要用任何方法使它變干

2、。2 為了得到盡可能好的結(jié)果，對于干的離子交換纖維素（23和32）預(yù)處理的每一步必須按下面即將介紹的流程進行操作。3 DE51、QA52、SE52和SE53含防腐劑。此類物質(zhì)會在平衡和裝柱時自動隨之除去。如果離子交換劑還進行平衡，則防腐劑可以用蒸餾水或者去離子水進行洗滌。第一部分 干型離子交換纖維素預(yù)處理1 稱量好的的離子交換劑添加到15倍容積（W/V）酸或堿溶液中輕輕攪動，進行第一次處理。2 微粒產(chǎn)品至少浸泡30min，纖維狀產(chǎn)品至少浸泡60min。3 濾出上清液，用水洗至下列“中間pH”。4 再用15倍容積的酸或堿溶液浸泡進行二次處理，放置30min，濾出上清液。5 重復上述“4”二次處理

3、，然后用水洗至洗液呈中性。處理條件型號 一次處理 中間pH 二次處理DE 0.5NHCl 4.0 0.5NNaOH CM 0.5NNaOH 8.0 0.5NHCl注意：對預(yù)溶脹的微粒狀產(chǎn)品（51，52和53型）不需進行這一步，因此干型產(chǎn)品用在大規(guī)模柱層析分離更好。第二部分 預(yù)溶脹型離子交換纖維素和預(yù)處理后的干型離子交換纖維素 交換劑懸浮液的準備一般QA52型和SE52型全離子化交換劑在用低離子濃度緩沖液中平衡時間比DE52和CM52型更短。而且所有介質(zhì)當采用的緩沖液離子與離子交換劑的相一致時，所需的平衡液體積最小，例如采用三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸緩沖液（Tris HCl Buffer）對DE或

4、QA型離子交換劑平衡所需時間和體積都要比用醋酸鹽類緩沖鹽少。所有情況下實際采用的起始緩沖液濃度比需要的起始緩沖液濃度高，（典型的高10倍），這樣有利于交換劑的預(yù)平衡。下面介紹的是更可取的平衡方法。離子交換劑裝柱后在進樣品前必須用低離子濃度的緩沖液進行平衡，通常將2-4倍柱床容積的低濃度緩沖液通過填充柱就可以完成平衡。推薦的方法1 在使用之前用緩沖液（0.2-1.0M）輕輕搖動攪拌離子交換劑2-3min。最初取干型纖維素時每克干品約用15-30mL緩沖液，濕離子交換劑約用6mL/g。2 在攪拌時緩沖液的酸或堿成分使緩沖液/離子交換劑懸液的pH調(diào)到所希望的值。3 讓懸液沉降并傾出上清液中的細小顆粒

5、。4 再次使用緩沖液使離子交換劑松散。干型離子交換劑懸液的總?cè)莘e按30mL/g計，濕離子交換劑約為6mL/g。5 離子交換劑和緩沖液的懸液在合適的量筒中沉降，并置于無灰塵、無直射陽光和不發(fā)熱的地方，沉降時間可按t = nh 式計算。式中：t = 時間（min），h = 量筒中懸液總高度（cm），n = 系數(shù)可取1.32.4。6 注意“濕沉降體積”是離子交換劑在規(guī)定條件下沉降后所占的體積。除去上清液中所含細粒后留在量筒中的最終體積是“濕沉降體積”加20%。7 填裝短柱或長柱時懸液可以選用上述密度，但是纖維狀產(chǎn)品的長柱床的密度需用“濕沉降體積”加50%。變換緩沖液可用的方法1 按上項（1）那樣輕輕

6、攪拌離子交換劑到一定容積的緩沖液中。2 放置10min，傾出或濾出上清液。3 重復處理直到濾液或上清液確實與緩沖液的pH和電導率一樣為止。變換緩沖液后必須核對pH。當采用低濃度緩沖液時本方法會有所變化，且需要增加處理的時間。4 除去細顆粒和裝柱的準備工作請按上述（4）（5）和（6）項進行。裝柱在裝柱時必須避免離子交換劑和緩沖液的對流翻動。為此必須使懸浮液倒入柱中瞬間使離子交換劑形成沉降柱床曾，操作進行得盡可能快，否則懸液中的對流需很長時間才會停下來。1 離子交換用柱應(yīng)該垂直置于無灰、無直射陽光和不發(fā)熱等環(huán)境中。2 假如選液體積大于柱體積時，應(yīng)該另外接一段延長管。3 輕輕攪動下將懸液倒入柱中。4

7、 讓洗脫液從柱中排出。5 全部懸液加完后裝上或插入柱頂蓋。6 緩沖液用泵或流動法通過柱子，流速控制至少45ml/hr/cm2柱子內(nèi)截面積，直到柱床高度恒定。7 停止緩沖液流進或流出柱子。8 取下延長管（若裝著）并換上柱頂蓋。平衡需要強調(diào)的是必須正確讀取pH和電導率。對真正的平衡而言平衡后的溶液應(yīng)該與起始緩沖液一致，必須做到不僅連續(xù)兩次平衡溶液的讀數(shù)相同，而且要去起始緩沖液相同。不正確的平衡是產(chǎn)生無重現(xiàn)性結(jié)果的原因。 起始緩沖液流過柱子直到流出液的電導率和pH精確地與起始緩沖液相同。此方法適用于開始時用低濃度緩沖液的柱分離。樣品準備和加樣樣品溶于起始緩沖液中并調(diào)整溶液的pH。細胞提取物和硫酸銨沉

8、淀物要用層析柱起始緩沖液透析。這一步不注意就有可能得到無法重現(xiàn)的結(jié)果。被分離物通常在低流速時加樣。 洗脫加樣品后立刻開始洗脫或在規(guī)定時間內(nèi)開始。層析分離通常采用三種方法。有分步洗脫、連續(xù)梯度洗脫和分段梯度洗脫。分步洗脫離子交換劑平衡和樣品混合物準備時所有緩沖液也可在洗脫時用，洗脫可以有兩種方式完成：1 目的物分子是游離狀態(tài)的。所需離子交換劑量要根據(jù)混合物污染程度、結(jié)合力和成分不同而定。柱床高度在這種方式操作中并不重要。2 目的物分子是結(jié)合狀態(tài)的。層析時混合物是由相類似的成分組成的，為了獲得最佳分離應(yīng)選用相對長的柱子。可取的是只用了柱總?cè)萘康暮苄∫徊糠郑ㄈ?%）。應(yīng)避免離子交換劑平衡和柱中層析分

9、離兩者選用不同的緩沖液，除非系統(tǒng)已經(jīng)明確顯出會得到錯誤的結(jié)果時才考慮。梯度洗脫連續(xù)地或分段地改變緩沖液的組分用于有效分離。緩沖液的組分變化可以是提高一種離子濃度或改變適當?shù)膒H，或者兩者都改變。緩沖液本身是達到分離目的的主要因素，離子交換劑的量需要按離子交換劑對目的化合物的交換容量而定。萬一混合物含層析相近似的組分時，為了獲得好的分辨力需要稍增加些柱長度。特殊技術(shù)滅菌所有whatman離子交換介質(zhì)除P11型之外為了滅菌都可以高壓滅菌。最好是離子交換劑用PH6.57.5的非揮發(fā)性緩沖液配成的懸液中進行。建議的滅菌條件是10psi/15min；或者15psi/10min；。另外除P11型之外所有的

10、產(chǎn)品也可以用化學滅菌法，將介質(zhì)分散在0.5MNaOH中，然后用滅菌水洗滌。所有產(chǎn)品也可用含2025%體積百分比的乙醇水溶液處理。脫氣（對陰離子交換劑）對大多數(shù)靈敏的分離，為了獲得重現(xiàn)性好的結(jié)果，DE和QA纖維素交換劑需除去吸附的二氧化碳。假如懸液預(yù)先按上述推薦的方法處理過后一般就不必進行這一步。1 將纖維素加到酸性緩沖液中。2 調(diào)整pH在4.5。有時甚至要用更高濃度的酸溶液來調(diào)節(jié)pH。3 在攪拌下抽真空（壓力降至10cmHg以下）直到?jīng)]有更多的氣泡產(chǎn)生，在不產(chǎn)生沸騰之后停止真空。較合適的是在抽濾瓶中帶磁力攪拌器攪拌下進行，抽濾瓶與吸氣器相連。4 加堿性緩沖液使得所希望的pH。對要求更高的分離，所用緩沖液必須用除CO2的水配制以保證無CO2。采用含醇緩沖液對SE53型介質(zhì)需要含醇緩沖液，平衡時先用水緩沖液處理，然后再用含醇緩沖液系統(tǒng)完成平衡。分批法離子交換1 將一定量的已預(yù)處理并平衡過無細粒的離子交換劑加到原溶液中。2 按原溶液中所含成分的容量攪動一定時間進行吸附分離。3 用過濾法或者離心法將離子交換劑