青藤堿對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥免疫功能的影響(一)

1、青藤堿對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥免疫功能的影響(一)    作者：陳方軍 葉麗 胡偉 張榮宜 程遠(yuǎn)華【摘要】 【目的】觀察青藤堿（SINO）對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠炎癥免疫功能的影響?！痉椒ā窟x用SD大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，SINO低、中、高劑量組（劑量分別為60、120、240mg/kg），雷公藤多苷（TPT）組（劑量為30mg/kg）；除正常組外，其他組均采用弗氏完全佐劑足跖皮內(nèi)注射復(fù)制AA模型；各組于造模后第12天開(kāi)始給藥，連續(xù)12d；觀察不同時(shí)間段的大鼠足趾腫脹度及關(guān)節(jié)評(píng)分；采用放射免疫法檢測(cè)滑膜細(xì)胞白細(xì)胞介素1（IL1）、腫瘤壞死因子（TNF

2、）的含量；觀察各組大鼠滑膜細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)各組滑膜細(xì)胞IL1 mRNA、TNFmRNA的表達(dá)。【結(jié)果】各劑量組SINO均可不同程度降低大鼠足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎評(píng)分，抑制滑膜細(xì)胞產(chǎn)生IL1、TNF，降低滑膜細(xì)胞IL1 mRNA、TNFmRNA的表達(dá)（P0.05或P0.01），恢復(fù)AA大鼠滑膜細(xì)胞的形態(tài)?！窘Y(jié)論】SINO治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用可能與其能抑制滑膜細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)，恢復(fù)滑膜細(xì)胞形態(tài)有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 青藤堿/藥理學(xué)； 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕/中藥療法； 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕/免疫學(xué)； 滑膜細(xì)胞/超微結(jié)構(gòu)；疾病模型，動(dòng)物； 大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arth

3、ritis，RA）是一種慢性全身性自身免疫性疾病，病理基礎(chǔ)為關(guān)節(jié)滑膜炎，病因不明，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，嚴(yán)重危害了人類的身體健康。青藤堿（sinomenine，SINO）是從中藥青風(fēng)藤中提取的生物堿單體，具有抗炎、免疫抑制、鎮(zhèn)痛、降壓、抗心律失常等藥理作用1-2。本研究以佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠為模型，觀察SINO對(duì)AA大鼠滑膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及分泌炎性細(xì)胞因子的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。1 材料與方法1.1 動(dòng)物 SD大鼠,普通級(jí),體質(zhì)量180200g，雄性，由安徽省醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：皖醫(yī)動(dòng)準(zhǔn)01號(hào)。1.2 藥物及試劑 青藤堿（湖南正清制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：0009101）；新生小牛血清（杭

4、州四季青生物工程材料有限公司提供，批號(hào)：031020）；RPMI1640粉（Sigma 公司提供）；雷公藤多苷片（TPT，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：060503）；卡介苗（BCG，衛(wèi)生部上海生物制品研究所產(chǎn)品，批號(hào)：20060101）；RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco 公司產(chǎn)品）；125IIL1放免試劑盒購(gòu)于北京北方生物研究所，其他試劑為分析純。IL1引物大小377bp，上游：5TTGTGGCTGTGGACAAGCTG3，下游：5GCCGTCTTTCATACACAGGG3；TNF mRNA 引物大小249bp；上游：5CTGGGCAGCGTTTATTCT3，下游：5TTGCTTCT

5、TCCCTGTTCC3；內(nèi)參照actin引物大小147bp，上游：5CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC3，下游：5CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG3；以上引物均由上海生工公司合成。1.3 儀器 JT12001型電子天平由上海精天電子儀器廠生產(chǎn)；YLSTA足趾容積測(cè)量?jī)x由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站生產(chǎn)；水套式CO2培養(yǎng)箱為美國(guó)SHELLAB產(chǎn)品；GL20A全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)由湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠生產(chǎn)；YJ1450型醫(yī)學(xué)凈化工作臺(tái)由蘇州凈化設(shè)備公司生產(chǎn)；倒置式顯微鏡為日本Olympus產(chǎn)品；J1230型透射電鏡為日本電子公司產(chǎn)品；GC911型放射免疫計(jì)數(shù)儀由中國(guó)科學(xué)

6、技術(shù)大學(xué)中佳公司生產(chǎn)。1.4 分組、給藥及造模 SD 大鼠隨機(jī)均分為6組：正常組，模型組，SINO 低、中、高劑量組（60、120、240mg/kg）和TPT組（30mg/kg），每組10只。按文獻(xiàn)報(bào)道造模3，除正常組外，其他各組均以弗氏完全佐劑（卡介苗80、1h水浴滅活后與高壓滅菌的液體石蠟充分碾磨混勻配成10mg/mL的乳劑）于每鼠左后足趾皮內(nèi)注射0.1mL致炎。各給藥組分別于致炎第12天開(kāi)始灌胃給藥，連續(xù)12d，正常組及模型組給予等容積的溶媒。1.5 AA大鼠評(píng)價(jià) 參照文獻(xiàn)3，采用足趾容積儀排水法測(cè)定右踝關(guān)節(jié)以下的容積（mL），分別于用藥前、用藥后第4、8、12、16天同法測(cè)量非致炎足的

7、容積變化，以致炎前后差值表示其腫脹度（V腫脹）。多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評(píng)分如下，0分：無(wú)腫脹；1分：1個(gè)趾關(guān)節(jié)受累；2分：多趾關(guān)節(jié)受累；3分：踝關(guān)節(jié)以下受累；4分：全爪受累。1.6 滑膜細(xì)胞培養(yǎng) 致炎后第28天大鼠清醒狀態(tài)下股動(dòng)脈放血處死。無(wú)菌取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織，滑膜細(xì)胞培養(yǎng)按文獻(xiàn)4-5方法進(jìn)行。以RPMI1640重懸細(xì)胞1×109個(gè)/L，取500L細(xì)胞懸液和10mg/L脂多糖（LPS）500L置6孔板中，37、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育48h，收集上清液，-20儲(chǔ)存，按125I放免試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行白細(xì)胞介素1（IL1）、腫瘤壞死因子（TNF）含量測(cè)定。1.7 透射電鏡檢查 收集滑膜細(xì)

8、胞以體積分?jǐn)?shù)4%戊二醛Millonings緩沖液預(yù)固定，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，10g/L鋨酸固定2h，梯度乙醇逐級(jí)脫水；環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察攝像。1.8 滑膜組織IL1 mRNA、TNF mRNA的檢測(cè) 滑膜組織IL1、TNF總RNA提取采用常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）4，用凝膠圖像分析儀掃描，Lab Image 3.2凝膠圖像分析軟件求出目的條帶灰度與內(nèi)參照actin標(biāo)準(zhǔn)條帶的比值（p）。1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS14.0軟件進(jìn)行方差分析。2 結(jié)果2.1 SINO對(duì)AA大鼠繼發(fā)性炎癥的影響 表1結(jié)果顯示，SINO給藥24d后開(kāi)始

9、發(fā)揮療效，各劑量組SINO均可顯著抑制AA大鼠的繼發(fā)性足腫脹（P0.01），以SINO高劑量組作用最顯著。2.2 SINO對(duì)AA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎影響 表2結(jié)果顯示，致炎后第16天，模型組大鼠非致炎足關(guān)節(jié)開(kāi)始出現(xiàn)紅腫、變形，行走不便。SINO各劑量組均可顯著抑制AA大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)病變（P0.05或P0.01）。表1 SINO對(duì)AA大鼠繼發(fā)性炎癥的影響統(tǒng)計(jì)方法：方差分析；P0.05，P0.01，與模型組比較表2 SINO對(duì)AA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的影響統(tǒng)計(jì)方法：方差分析；P0.01，與正常組比較；P0.01，與模型組比較2.3 SINO對(duì)滑膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 滑膜組織中有兩型滑膜細(xì)胞，A型滑膜細(xì)胞起

10、源于巨噬細(xì)胞，B型滑膜細(xì)胞起源于成纖維細(xì)胞。正?；そM織以B型細(xì)胞為主，其特征是粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體較多；與正常組大鼠相比，AA大鼠則多見(jiàn)A型滑膜細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)囊泡增多，A型細(xì)胞含明顯的高爾基體和囊泡分散于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少，線粒體腫脹、嵴突破壞；B型滑膜細(xì)胞數(shù)量減少。各給藥組大鼠以B型滑膜細(xì)胞為主，B型滑膜細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略有擴(kuò)張，但數(shù)量減少，少數(shù)線粒體腫脹，以SINO中、高劑量組和TPT組改善作用更為明顯，結(jié)果見(jiàn)圖1。2.4 SINO對(duì)IL1、TNF含量的影響 表3結(jié)果顯示，模型組IL1、TNF高表達(dá)，而SINO中、高劑量組對(duì)AA大鼠滑膜組織IL1、TNF的生成有顯著抑制作用（P0.05

11、或P0.01）。2.5 SINO對(duì)滑膜IL1 及TNF mRNA表達(dá)的影響 表4結(jié)果顯示，正常組IL1 及TNF mRNA低表達(dá)，模型組高表達(dá)（P0.05），SINO各劑量組均可不同程度降低IL1 及TNF mRNA高表達(dá)（與模型組比較，P0.05或P0.01），且呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。 表3 SINO對(duì)滑膜細(xì)胞產(chǎn)生IL1、TNF含量的影響統(tǒng)計(jì)方法：方差分析；P0.01，與正常組比較；P0.05，P0.01，與模型組比較表4 SINO對(duì)IL1 mRNA、TNF mRNA表達(dá)的影響統(tǒng)計(jì)方法：方差分析；P0.05，與正常組比較；P0.05，P0.01，與模型組比較3 討論在RA的病理過(guò)程中，滑膜炎

12、的一個(gè)重要特征是不能控制的滑膜細(xì)胞增殖，這種基質(zhì)成纖維樣細(xì)胞的增殖被認(rèn)為是"腫瘤樣"的，具有較大的破壞性且重復(fù)出現(xiàn)，最終侵襲軟骨，造成軟骨和骨的破壞5?；そM織和關(guān)節(jié)腔內(nèi)的A型滑膜細(xì)胞有吞噬異物的作用，占滑膜細(xì)胞總數(shù)的10%左右； B型滑膜細(xì)胞為主要的滑膜細(xì)胞，能合成和修飾所有的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和滑液成分，其分泌的透明質(zhì)酸在潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、營(yíng)養(yǎng)肌腱等方面發(fā)揮重要作用,具有較強(qiáng)的損傷修復(fù)能力7。通過(guò)對(duì)各組滑膜組織超微結(jié)構(gòu)的觀察，發(fā)現(xiàn)SINO能顯著增加B型滑膜細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)降低A型滑膜細(xì)胞的數(shù)量，提示SINO在調(diào)節(jié)炎癥致滑膜細(xì)胞分化異常，促使炎癥修復(fù)方面起著一定的作用。RA中的

13、滑膜細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞處于高度活化狀態(tài)，可合成IL1與TNF等多種炎性細(xì)胞因子。釋放入關(guān)節(jié)滑膜液及血液中的細(xì)胞因子IL1與TNF有許多相似的生物學(xué)活性，如促進(jìn)滑膜纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞生成膠原酶和前列腺素，誘導(dǎo)糖蛋白的分解與骨的吸收，抑制糖蛋白的合成與骨的形成，刺激B型滑膜細(xì)胞增生，使滑膜增厚，生成大量基質(zhì)金屬蛋白酶等6。從功能上分析，分布于A型滑膜細(xì)胞內(nèi)的高爾基復(fù)合體參與分泌活動(dòng)，線粒體則為細(xì)胞代謝提供能量；B型滑膜細(xì)胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有分泌蛋白質(zhì)等功能8。本研究通過(guò)對(duì)不同類型滑膜細(xì)胞具有分泌、代謝功能的細(xì)胞器進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA模型組在致炎后28d時(shí)，滑膜細(xì)胞的代謝活性及IL1 、 T

14、NF 分泌功能均有所亢進(jìn)；各治療組A、B型滑膜細(xì)胞中高爾基體、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、囊泡的數(shù)量均有所減少，表明SINO可降低亢進(jìn)的滑膜細(xì)胞功能，保護(hù)滑膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而減輕滑膜細(xì)胞變性。在本研究中，AA大鼠滑膜細(xì)胞釋放較高水平的IL1、TNF，SINO可抑制IL1、TNF的產(chǎn)生，下調(diào)致炎因子IL1 mRNA、TNF mRNA的表達(dá)。表明SINO可通過(guò)降低AA大鼠滑膜細(xì)胞活化而減輕繼發(fā)性炎癥，該抑制滑膜細(xì)胞分泌亢進(jìn)的功能與透射電鏡觀察到滑膜細(xì)胞具分泌功能細(xì)胞器形態(tài)改變的結(jié)果一致。因此，SINO治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用可能與其能抑制滑膜細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)，恢復(fù)滑膜細(xì)胞形態(tài)有關(guān)。【參考文獻(xiàn)】1王勇，方勇飛

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