TT病毒感染病人肝組織中TT病毒分布特點(diǎn)研究

1、    TT病毒感染病人肝組織中TT病毒分布特點(diǎn)研究            作者：時(shí)間：2007-11-22 13:10:00                           

2、                作者：鄧傳珍 李銀鵬 姜嶺梅 朱惠明【關(guān)鍵詞】  原位PCR 【摘要】 目的 探討TT病毒感染病人肝組織中TT病毒分布特點(diǎn)。方法 建立改良原位PCR技術(shù)，用以檢測(cè)血清TT病毒陽(yáng)性病人的肝組織標(biāo)本，觀察TT病毒在肝組織中分布特點(diǎn)。結(jié)果 在肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中，TT病毒主要分布在細(xì)胞核。結(jié)論 TT病毒是一種嗜肝性病毒，肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核是其復(fù)制場(chǎng)所。關(guān)鍵詞 原位PCR 肝組織 TT病毒

3、【Abstract】 Objective To explore distribution of TT virus in liver tissuein patients infected with TT virus.Methods A modified in situ PCR for TTvirus was established.Hepatic specimens of patients with positive test for TT virus was examined to observe distribution of TT virus in liver tissue.Results

4、 TT virus was distributed in the nucleus of hepatocytes，hepatic carcinoma cells and endoth eliocytes in liver.Conclusion TTV is hepatotropic virus and the duplication is mainly in the nucleus of target cells.Key words in situ PCR liver tissue TT virus TT病毒是一種單鏈環(huán)狀DNA病毒 1，2 ，TT病毒感染者肝臟中病毒的分布及其意義目前

5、尚不清楚。我們建立了改良原位PCR法并檢查血清TT病毒DNA陽(yáng)性病人的肝組織標(biāo)本80例，以觀察TT病毒感染病人肝組織中TT病毒的分布特點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)告如下。1 材料與方法1.1 材料3 報(bào)道的TTV基因序列，采用Goldkey軟件，在TTV開放讀碼框1（ORF1）的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)兩對(duì)套式引物，委托上海Sangon生物工程公司合成。3 、T 4 為引物，T 2 的5-端以地高辛標(biāo)記，委托上海sangon生物工程公司合成。1.2 方法2 10.8l，dNTPs4.8l，T 2 、T 3 各1.2l，BSA2.4l，水加至60l。94變性3min，按下列參數(shù)循環(huán):941.5min，562min。2 檢驗(yàn)。

6、2 結(jié)果TT病毒在肝組織中的分布特點(diǎn)見表1。肝炎、肝硬化和外傷性肝破裂病人的肝臟中，TT病毒主要分布在肝細(xì)胞核內(nèi)與內(nèi)皮細(xì)胞核內(nèi)，極少數(shù)位于肝細(xì)胞漿內(nèi)。肝炎標(biāo)本中，TT病毒呈散在分布，匯管區(qū)周圍稍密集，肝硬化標(biāo)本假小葉內(nèi)TT病毒呈散在分布。肝癌細(xì)胞中TT病毒位于肝癌細(xì)胞核內(nèi)，癌組織周圍肝細(xì)胞內(nèi)TT病毒散在分布。表1 不同肝病肝臟標(biāo)本中TT病毒分布特點(diǎn) （略）  3 討論巢式PCR技術(shù)是診斷血清中存在TT病毒的主要方法 4 。然而血清TT病毒檢測(cè)結(jié)果并不能反映TT病毒感染后在肝組織中的定位與分布。我們應(yīng)用改良原位PCR技術(shù)對(duì)病人血清TT病毒陽(yáng)性病人的肝臟標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果表明，TT病

7、毒感染肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞后，主要分布特點(diǎn)是在細(xì)胞核內(nèi)，極少數(shù)分布在細(xì)胞漿。這種分布特點(diǎn)從形態(tài)學(xué)上提示TT病毒具有嗜肝性，其復(fù)制場(chǎng)所主要在其靶細(xì)胞核。在肝細(xì)胞癌標(biāo)本中，可見TT病毒分布于肝癌細(xì)胞核內(nèi)及肝癌組織周圍，這種分布特點(diǎn)是否能提示TT病毒與肝細(xì)胞癌之間的關(guān)系，尚待進(jìn)一步研究。本研究對(duì)原位PCR法進(jìn)行了改進(jìn)，檢測(cè)效果較好。長(zhǎng)期以來，人們用直接原位PCR法通常用放射性同位素、地高辛或生物素標(biāo)記dUTP。但實(shí)驗(yàn)證明直接原位PCR法檢測(cè)肝臟TT病毒感染效果很不理想。用dig-11-dUTP標(biāo)記TT病毒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，以此檢測(cè)肝臟標(biāo)本時(shí)假陽(yáng)性率極高。即使在缺少引物的條件下仍出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，表明

8、競(jìng)爭(zhēng)摻入標(biāo)記與引物無關(guān)。產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)的原因是標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定和蛋白酶K處理后，核酸鏈出現(xiàn)缺口 5 ，在PCR擴(kuò)增過程中，Taq酶非特異地修復(fù)并擴(kuò)增這些缺口，引起dig-11-dUTP非特異性地?fù)饺?，?jīng)親合組化顯色后，出現(xiàn)假陽(yáng)性信號(hào)。為了解決上述難題，我們將地高辛直接標(biāo)記在引物5-端，這樣既不影響正常PCR反應(yīng)，同時(shí)可避免標(biāo)記分子的非特異性摻入。改良原位PCR技術(shù)使用的引物選自TT病毒DNA ORF1中的保守序列，經(jīng)特異性擴(kuò)增ORF1中的272nt片段，出現(xiàn)紫藍(lán)色陽(yáng)性信號(hào)即表明TT病毒存在。而省略引物、省略Taq酶或用DNase預(yù)處理標(biāo)本 后均無陽(yáng)性信號(hào)，表明改良原位PCR檢測(cè)肝臟TT病毒感

9、染的特異性強(qiáng)。 參考文獻(xiàn)1 Miyata H，Tsunoda H，Kazi A，et al.Identification of a novel GC-rich113-nucleotide region to complete the circular，single-stranded DNA genome of TTvirus，the first human circovirus.J Virol，1999，73，3582-3586.2 Gu J.Principles and application of in situ PCR.Cell Vision，1994，1:8-9.3 Okamoto H，Nishizawa T，Kato N，et al.Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus（TTV）associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology.Hepatol Res，1998，10:1-16.4 馬為民，周伯平，王火生.一種新的可經(jīng)輸血轉(zhuǎn)播病毒（TTV）的分子流行病學(xué)研究.中華肝臟病雜志，1998，6:167-169.5 Musso O，Sommer P，Drouet E，et al.In situ detectio