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認證類型：個人認證

認證主體：李**（實名認證）

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IP屬地：湖北 上傳時間：2022-01-26 格式：DOC 頁數(shù)：44 大?。?4KB 積分：25 舉報 版權申訴

1、    丁基苯酞對缺血腦組織中及低糖低氧刺激后培養(yǎng)的神經(jīng)細胞中膽堿乙酰化酶活性的影響        摘要目的：觀察丁基苯酞(dl-NBP)，d-NBP和l-NBP對腦缺血后皮層和紋狀體中以及低糖低氧和NMDA刺激后培養(yǎng)的胎鼠皮層神經(jīng)元中膽堿乙?；富钚宰兓挠绊?。方法：大腦中動脈堵塞起始處造成大鼠局灶性腦缺血；胎鼠皮層神經(jīng)元以低糖低氧培養(yǎng)基培養(yǎng)造成低糖低氧模型；膽堿乙?；富钚砸苑止舛确ㄟM行測定。結果：腦缺血后缺血區(qū)皮層和紋狀體中膽堿乙?；富钚苑謩e下降了61.3%和58.4

2、%。dl-NBP，d-NBP和l-NBP(10和20mg；g-1，ip)于腦缺血后5和60min給藥2次皆可顯著提高腦組織中膽堿乙?；富钚浴l-NBP，d-NBP和l-NBP(0.110mol.L-1)對低糖低氧及NMDA刺激后神經(jīng)細胞中膽堿乙酰化酶活性也有明顯的提高作用。結論：dl-NMP改善局灶性腦缺血后動物的學習記憶功能可能與其對膽堿能神經(jīng)功能的改善有關鍵詞丁基苯酞；腦缺血；神經(jīng)元；低糖低氧；膽堿乙?；窫ffect of dl-3-n-butylphthalide on the activity of the choline acetyltransferase in ischemi

3、c brain and cultured neurons subjected to hypoglycemia/hypoxiaChong Zhaozhong (Chong ZZ),Feng Yipu (Feng YP) (Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College,Beijing100050)ABSTRACTOBJECTIVE:To investigate the effects of dl-3-n-butylphthalide (dl-NBP),d-NB

4、P and l-NBP on the activity of choline acetyltransferase (ChAT) in ischemic brain after focal cerebral ischemia and in neurons subjected to hypoglgcemia/hypoxia.METHODS:Focal cerebral ischemia was induced by blockade of the origin of middle cerebral artery (MCAO) and perinatal cortical rat neurons w

5、as cultured with hypohlycemia/hypoxic medium to induce hypoglycemia/hypoxia injury.The activity of ChAT was determined spectrophotometrically.RESULTS:The results indicated that the activity of ChAT was decreased by 61.3% and 58.4% respectively in cerebral cortex and striatum after six hours of MCAO.

6、dl-NBP,d-NBP and l-NBP (10 and 20mg.kg-1，ip) were shown to increase ChAT activity in ischemic brain significantly.The decreased activity of ChAT in cultured perinatal rat cortical neurons induced by hypoglycemia/hypoxia or by NMDA was also improved by dl-NBP,d-NBP and l-NBP (0.110mol.L-1).CONCLUSION

7、:The effect of dl-NBP on learning and memory function impaired by focal cerebral ischemia may be related to its protective effect on the activity of choline acetyltransferase.KEYWORDSdl-3-n-butylphthalide,cerebral ischemia,neuron,hypoglycemia/hypoxia,choline acetyltransferase我們的實驗發(fā)現(xiàn)，丁基苯酞(dl-3-n-buty

8、lphthalide,dl-NBP)對大腦中動脈阻斷后的大鼠1及閉合性腦外傷后小鼠記憶功能障礙皆有明顯的改善作用。大腦中動脈阻斷后主要導致皮層和紋狀體及基底節(jié)等部位缺血。海馬和顳葉皮層是與學習記憶功能重要的相關部位。而中樞膽堿能神經(jīng)功能在學習記憶過程中發(fā)揮重要作用。膽堿乙?；笧槟憠A能神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的合成酶，其活性可反應膽堿能神經(jīng)的功能狀態(tài)。本實驗我們測定了腦缺血后皮層和紋狀體中膽堿乙?；富钚缘淖兓⒂^察了藥物治療后對其活性的影響；在培養(yǎng)的胎鼠皮層神經(jīng)元上，進一步研究了dl-,d-和l-NBP對低糖低氧及NMDA刺激后膽堿乙酰化酶活性變化的影響。1材料和方法1.1藥品與試劑丁基苯酞(dl-

9、NBP，本所藥物化學合成室提供)；乙酰輔酶A(Sigma公司)；4，4?-二亞硫基二吡啶(4-PDS，Sigma公司)；MK801(Sigma公司)；N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA，MW147.13，Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；多聚賴氨酸(Sigma公司)；阿糖胞苷(Up-John公司)。1.2局灶性腦缺血模型Wistar大鼠(，中國醫(yī)學科學院動物繁育中心)，體重(254±8)g，以100g.L-1的水合氯醛麻醉(400mg.kg-1,ip)，室溫保持在2425,動物體溫以白熾燈(100W)維持在37左右。動物仰臥固定，沿頸部中線切開皮膚及皮下組織。手術顯微

10、鏡下分離右側頸總動脈及其頸內(nèi)和頸外分枝。結扎頸外動脈的小分枝及終末枝。夾閉頸總和頸內(nèi)動脈，將預先硅化的直徑為0.26mm的尼龍線插入頸外動脈，穿過頸內(nèi)和頸外動脈分叉處進入頸內(nèi)動脈。松開頸內(nèi)動脈，繼續(xù)將尼龍線插入到頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段，當感到明顯的插入阻力時，此時自頸內(nèi)動脈起始部的插入長度約為2.0cm，表明線的頭端已穿過大腦中動脈起始部。然后將頸外動脈殘段用絲線結扎，以防插線脫落。大腦中動脈阻斷后5h，觀察動物有無腦缺血體征：提起鼠尾，左前肢內(nèi)旋肩內(nèi)收；置動物于光滑平面上，向健側的推擋阻力減弱；左前肢肌力減弱。棄去無上述任何體征的動物。腦缺血后6h，斷頭處死動物，迅速取出前腦，冰上分離右側皮層和紋狀

11、體，稱重，加入1ml Tris-HCl(pH7.0)勻漿，用EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二鈉)10mmol/Triton X-100 0.5%液1ml稀釋，混勻，取40l用于膽堿乙?；富钚缘臏y定。將動物分成9組進行實驗：假手術(Sham)組，本組動物手術操作過程同上，但不插線；溶劑對照(Vehicle)組，分別于腦缺血后5和60min ip 0.5% Tween-80 1 ml.kg-1；dl-NBP 10mg.kg-1組；dl-NBP 20mg.kg-1組；d-NBP 10 mg.kg-1組；d-NBP 20 mg.kg-1組；l-NBP 10mg.kg-1組；l-NBP 20mg.kg

12、-1組；尼莫地平(Nim)0.5mg.kg-1組。39組給藥時間和次數(shù)同2組，每組56只動物。1.3皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)參考Choi方法2并略加修改。選1418d的清潔級孕大鼠，100g.L-1的水合氯醛麻醉(400mg.kg-1，ip)。75%乙醇消毒腹部后，暴露腹腔。自子宮中取出胎鼠，倒T字型剪開顱骨，取下兩側皮層組織，于盛有DMEM培養(yǎng)基(含10%小牛血清，10%馬血清，青鏈霉素各100u.ml-1)的小燒杯中用眼科剪剪成糜狀，經(jīng)吹打分散，200目細胞篩過濾后，以DMEM培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)至106ml-1，接種至預先用0.1g.L-1的多聚賴氨酸鋪蓋過的24孔培養(yǎng)板，每孔1ml，置二氧化

13、碳孵箱(Precsion Scientific)中孵育24h后換液，以后每3d換液1次，于培養(yǎng)第7天，換以含10mol.L-1阿糖胞苷的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的生長。換回正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至第12天。1.4低糖低氧誘導的神經(jīng)元損傷細胞培養(yǎng)至第12天，換以含各種藥物預先用N2飽和的低糖培養(yǎng)基(含葡萄糖1000mg.L-1)，CO2孵箱中溫孵10h后，吸出培養(yǎng)液后，每孔中加入0.2g.L-1 EDTA2-Na 0.5ml消化細胞15min，然后將細胞懸液收集在1.5ml的離心管中，冰凍保存?zhèn)溆?。實驗主要分以?組進行：正常對照(Normal)組，細胞培養(yǎng)至第14天，換以正常高

14、糖DMEM培養(yǎng)基(含血清)，溫孵10h后，收集細胞。溶劑對照(Vehicle)組，低糖低氧環(huán)境，加入50mol.L-1的聚乙二醇 10l。給藥組，細胞在低糖低氧環(huán)境中培養(yǎng)10h并加入不同濃度的各種藥物(dl-NBP，d-NBP或l-NBP)(濃度為0.110mol.L-1)。1.5NMDA誘導的神經(jīng)元損傷細胞培養(yǎng)第14天，換以正常含血清DMEM培養(yǎng)基，每孔中加入10mmol.L-1 NMDA 10l，使其終濃度為0.1mmol.L-1，于CO2孵箱中孵育45min后，以0.2g.L-1EDTA-2Na消化細胞，冰凍保存?zhèn)溆?。實驗分組：正常對照(Normal)組，細胞培養(yǎng)至第14天，換以正常高糖

15、DMEM培養(yǎng)基(含血清)，溫孵45min后，收集細胞。溶劑對照(Vehicle)組，培養(yǎng)基中加入NMDA(N-甲基-D-門冬氨酸)和50ml.L-1的聚乙二醇10l。給藥組，NMDA損傷并加入不同濃度的各種藥物(dl-NBP，d-NBP，l-NBP 0.1，1，10mol.L-1)或陽性對照藥MK801 1mol.L-1。1.6膽堿乙酰化酶活性的測定膽堿乙?；?ChAT)活性測定參照文獻3以分光光度法進行測定。反應體系中含8×10-2mol.L-1磷酸緩沖液，1.03×10-3mol.L-1乙酰輔酶A，0.17mol.L-1的氯化膽堿，1.52×10-4mol.

16、L-1甲基硫酸新斯的明，0.5mol.L-1 NaCl和1.7×10-4mol.L-1的EDTA-2Na。該混合體系于37溫孵5min，加入40l樣本后于37溫孵20min，然后沸水浴中放置2min終止反應。冷卻后加入適量氮氣飽和的蒸餾水和1.7×10-4mol.L-1的4，4-二硫二 吡啶反應總體積為1.2ml。于室溫中放置15min后記錄在324nm處的吸光度。以體系中輔酶A的生成量作為衡量ChAT活性的標準。組織中ChAT活性以每毫克組織在反應體系中生成輔酶A的nmol表示；細胞中ChAT活性以每毫克蛋白在反應體系中生成輔酶A的nmol表示，以Lowry法測定蛋白含量

17、。1.7統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)皆以±s表示。各組間差異用方差分析(ANOVA檢驗)，兩組間比較用t檢驗。2結果2.1對腦缺血后腦組織中ChAT的影響大腦中動脈阻斷6h，缺血側皮層和紋狀體中ChAT活性顯著降低，與假手術組相比，分別下降了61.3%和58.4%，表明，腦缺血可致缺血區(qū)膽堿能神經(jīng)功能受損。腦缺血后5和60min給dl-NBP 10或20mg.kg-1，可使皮層組織中ChAT的活性較缺血對照組分別提高53.7%和95.5%，紋狀體中ChAT的活性分別提高58.6%和89.2%。經(jīng)鈣通道阻滯劑尼莫地平治療后，亦可見皮層和紋狀體中ChAT活性的降低明顯減輕(1)。1丁基苯酞(dl-

18、NBP)、及其左右旋體(l-NBP、d-NBP)和尼莫地平對大鼠局灶性腦缺血(6h)后大腦皮層和紋狀體中膽堿乙?；富钚?以體系中輔酶A的生成速度表示)的影響。±s,n=56。與假手術組比1)P0.01；與溶劑對照組比2)P0.05，3)P0.01觀察d-NBP和l-NBP治療后缺血腦組織中ChAT活性變化，發(fā)現(xiàn)二者對腦缺血所致的膽堿能神經(jīng)損傷皆有一定的保護作用。經(jīng)d-NBP10，20mg.kg-1治療后，可見皮層組織中ChAT的活性分別提高至(3.25±1.12)和(3.76±0.40) nmol.min-1.mg-1(較溶劑對照組提高33.2%和54.1%)，

19、紋狀體中ChAT活性提高至(4.20±0.69)和(5.69±0.88)nmol.min-1.mg-1(較溶劑對照組提高61.3%和118.0%)。l-NBP 10，20mg.kg-1則分別將皮層組織中ChAT的活性提高45.9%(3.56±0.62)nmol.min-1.mg-1和75.4%(4.28±0.34)nmol.min-1.mg-1，紋狀體中ChAT的活性提高65.9%(4.33±0.68)nmol.min-1.mg-1和86.6%(4.87±0.79)nmol.min-1.mg-1(1)。2.2對低糖低氧誘導的神經(jīng)細胞損

20、傷后ChAT活性的影響原代培養(yǎng)的胎鼠皮層神經(jīng)元于低糖低氧環(huán)境中10h，可引起明顯的神經(jīng)細胞損傷，ChAT活性顯著降低。培養(yǎng)基中加入dl-NBP對低糖低氧所致的ChAT活性降低有明顯的逆轉(zhuǎn)作用，細胞液中ChAT活性較溶劑對照組分別提高2.1，2.7和3.4倍。但與正常對照組比較，給藥組ChAT活性仍顯著低于正常水平，說明dl-NBP對ChAT活性的增加作用有一定的限度。低糖低氧的同時給d-NBP 0.1，1或10mol.L-1，可見神經(jīng)細胞液中ChAT活性分別提高了1.8，1.8和2.8倍；給同樣劑量的l-NBP后，低糖低氧損傷引起的ChAT活性降低亦明顯減輕，ChAT活性分別較溶劑對照組提高1

21、.3，2.3和2.7倍(表1)。表1丁基苯酞(dl-NBP)及其左右旋體(l-NBP、d-NBP)和MK801對經(jīng)低糖低氧或NMDA處理(0.1mmol.L-1，45min)后原代培養(yǎng)的神經(jīng)細胞內(nèi)ChAT活性(nmol.min-1.mg-1)的影響.±s,n=6組別藥物濃度/mol.L-1損傷類型低糖低氧NMDANormal31.8±6.935.7±6.8Vehicle02.3±1.61）4.2±2.11）dl-NBP0.14.8±3.26.8±2.82）16.2±2.92）9.2±4.32）107.8&

22、#177;3.23）16.7±6.63）d-NBP0.16.6±4.12）5.9±2.916.4±2.33）13.9±6.23）108.7±4.53）14.8±6.73）l-NBP0.15.2±3.68.2±3.72）17.7±4.52）12.2±4.83）108.4±4.13）15.9±6.73）MK801116.3±5.83）注：與正常神經(jīng)元組比較，1)P0.01；與溶劑對照組比較，2)P0.05，3)P0.012.3對NMDA誘導的神經(jīng)元損傷后ChA

23、T活性的影響培養(yǎng)基中加入NMDA后終濃度為100mol.L-1于CO2孵箱中溫孵45min，可造成神經(jīng)元的明顯損傷，ChAT活性降至正常水平的1/8左右。NMDA損傷的同時，加入0.1，1或10mol.L-1的dl-NBP，可使ChAT活性提高至正常水平(35.74±6.82)nmol.min-1.mg-1protein的19.2%，25.7%和46.6%。同樣條件下培養(yǎng)基中加入d-NBP 1和10mol.L-1后，亦可見ChAT活性明顯增加，但d-NBP 0.1mol.L-1的作用不明顯；而l-NBP在濃度為0.1mol.L-1時表現(xiàn)出對ChAT活性的明顯提高作用。NMDA受體阻斷劑MK801也可明顯提高神經(jīng)細胞損傷后ChAT的活性。3討論本實驗結果顯示，dl-NBP對局灶性腦缺血后腦組織中ChAT活性的降低具有明顯的升高作用，表明dl-NBP對缺血后中樞膽堿能神經(jīng)功能可能有一定的保護作用，此作用對于缺血性腦損傷后中樞膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水平的維持具有重要意義，這可能是dl-NBP改善局灶性腦缺血后學習記憶功能的作用機制之一。dl-NBP對腦缺血后中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用可能是藥物的直接作用而并非通過提高缺血腦組織的局部腦血流4，改善腦組織的血氧供應的繼發(fā)性作用。其理由是d-NBP和l-NBP對局部腦血流的影響并不一致。研究表明，d-NB