基于川芎嗪預(yù)處理對心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷延遲保護(hù)作用分析

1、基于川芎嗪預(yù)處理對心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷延遲保護(hù)作用分析         你正在瀏覽的臨床醫(yī)學(xué)論文是基于川芎嗪預(yù)處理對心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷延遲保護(hù)作用分析                    【摘要】 目的 探討川芎嗪預(yù)處理對心肌缺血/再灌注損傷延遲保護(hù)作用。方法 實驗用SD新生(13 d)大鼠，雌雄不拘，無菌

2、取出乳鼠心臟，經(jīng)分離附著組織、胰蛋白酶消化及純化制成心肌細(xì)胞培養(yǎng)，第4 天隨機(jī)分為4組：正常對照(Control)組、缺氧/復(fù)氧(A/R)組、缺氧預(yù)處理(APC)組、川芎嗪(TMPZ)組。觀察心肌細(xì)胞搏動頻率、細(xì)胞存活率(MTT法)、培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活性。結(jié)果 細(xì)胞搏動頻率：缺氧/復(fù)氧組(13±3 )次/min，與正常對照組相比差異有顯著性(P<0.05);APC組(84±6) 次/min，TMPZ組(85±3)次/min，對正常心肌細(xì)胞搏動頻率無明顯影響(P>0.05)，與缺氧/復(fù)氧組比較差異有顯著性(P<0.05);APC組、TM

3、PZ組之間差異無顯著性(P>0.05);細(xì)胞存活率： 缺氧/復(fù)氧組(36.23±4.05)%，與正常對照組比較，差異有顯著性(P<0.05);APC組(83.76±6.92)%，TMPZ組(80.56±4.65)%分別與缺氧/復(fù)氧組比較，差異有顯著性(P<0.05)，APC組、TMPZ組之間差異無顯著性(P>0.05);LDH活性： 缺氧/復(fù)氧組(36.73±2.35) U/L與正常對照組比較，差異有顯著性(P<0.05);APC組(5.70±0.63 ) U/L、TMPZ組(5.74±0.34) U/L

4、，分別與缺氧/復(fù)氧組比較，差異有顯著性(P<0.05)，APC組、TMPZ組之間差異無顯著性(P>0.05)。結(jié)論 從細(xì)胞水平證實TMPZ預(yù)處理后24 h心肌細(xì)胞對再次缺氧/復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用。        【關(guān)鍵詞】 缺氧/復(fù)氧損傷;缺氧預(yù)適應(yīng);延遲保護(hù);川芎嗪        Abstract:Objective To investigate the delayed myocardioprotection of TMP

5、Z pre- conditioning. Methods Cultured myocardial cells of neonatal SD rats have been randomly divided into 4 groups: Control group; anoxia reoxygenation (A/R)group;anoxia preconditioning group(APC); TMPZ group; In each group, the cardiomyocytes were subjected to anoxia (3 hr) followed by reoxygenati

6、on (1 hr) 24 hr after anoxic (or TMPZ) preconditioning on the model of the cultured cardiomyocytes. At the end of experiment, myocardial cells beating rate, cell viability and the activity of LDH in culture were measured. Results Beating rate of ventricular myocytes: The beating rate was significant

7、ly slow in A/R group(13±3 beats/min) compared with that of control group(P<0.05); Between APC group(84±6 beats/min) and TMPZ group (85±3) beats/min, the beating rate was similar to each other(P>0.05),and compared with A/R , the beating rate was significantly increased(P<0.05)

8、;the cell viability:The cell viability of A/R(36.23±4.05)% was significantly decreased when compared with that of control group(P<0.05); the viability of APC (83.76±6.92)% ,TMPZ (80.56±4.65)% was significantly increased when compared with A/R respectively，(P<0.05),between APC an

9、d TMPZ, the cell viability was similar to each other(P>0.05);LDH activity: LDH activity of A/R (36.73±2.35 ) U/L was significantly increased when compared with Control group(P<0.05); LDH activity of APC(5.70±0.63 )U/L or TMPZ (5.74±0.34 ) U/L was significantly decreased when com

10、pared with A/R respectively (P<0.05),but LDH activity of TMPZ was similar to that of APC group(P>0.05).Conclusion TMPZ preconditioning can mimic the delayed protection on cultured neonatal rat myocardiocytes with hypoxia/reperfusion injury.        Key wo

11、rds: anoxia/reoxygenation; anoxia preconditioning; delayed protection; TMPZ        心肌缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic precoditioning，IPC)指一次或幾次短暫反復(fù)心肌缺血再灌注可使心肌在此后的持續(xù)缺血再灌注損傷中得到保護(hù)1。這一概念自1986年Murry等提出后，即為缺血心肌的保護(hù)及其機(jī)制的探索開辟一個新的領(lǐng)域，成為許多學(xué)者專家研究的熱點(diǎn)。根據(jù)保護(hù)效應(yīng)出現(xiàn)的時間，IPC被分為早期(early phase,EP)和延遲期(

12、delayed    phase,DP)2個階段2。EP發(fā)生于缺血后數(shù)分鐘,持續(xù)23 h;DP于缺血1224 h后出現(xiàn)、持續(xù)34 d。由于DP的持續(xù)時間長便于利用,成了臨床和實驗研究的重點(diǎn)。研究者們期望發(fā)現(xiàn)此類藥物或識別DP中合成的內(nèi)源性保護(hù)蛋白，擬在臨床有效地應(yīng)用IPC。川芎嗪是中藥川芎的主要生物堿，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是四甲基吡嗪(trtramethylpyrazine, TMPZ)。本研究在原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷及缺氧預(yù)處理模型上,觀察缺氧預(yù)處理后24 h對缺氧/復(fù)氧損傷的延遲保護(hù)作用。     &#

13、160;  1材料與方法        1.1實驗動物        由江西醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物科學(xué)部提供的SD大鼠的乳鼠(13 d)，雌雄不限,合格證號0219602。        1.2主要試劑        5Br2deoxyuridine (BrdU)

14、: Sigma公司產(chǎn)品;MEM培養(yǎng)基：GIBCO BRL公司產(chǎn)品;4(2hydroxyethyl)1piperazine ethanesulfonic acid (HEPES): Sigma公司產(chǎn)品;胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品;川芎嗪粉劑：中國藥品生物制品檢定所提供，生產(chǎn)批號：001026;青霉素鈉鹽：江西東風(fēng)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;鏈霉素：華美生物有限公司產(chǎn)品。        1.3實驗主要儀器和設(shè)備        超凈工

15、作臺：蘇州凈化設(shè)備廠;二氧化碳培養(yǎng)箱:長沙長錦應(yīng)用技術(shù)研究所;全自動生化分析儀:美國Beckman公司。        1.4方法        取2025只出生13 d的SD乳鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行無菌分離、純化、培養(yǎng)，參照Spector3等的方法略加改進(jìn)。將培養(yǎng)第4 天的原代心肌細(xì)胞隨機(jī)分4組：正常對照(Control)組、缺氧/復(fù)氧(A/R)組、缺氧預(yù)處理(APC)組、川芎嗪(TMPZ終溶度為100 mol/L)組;每組重復(fù)8次進(jìn)行缺氧

16、預(yù)處理、TMPZ預(yù)處理和缺氧復(fù)氧實驗。實驗結(jié)束后于倒置顯微鏡觀察并計數(shù)單位時間內(nèi)各組心肌細(xì)胞搏動的頻率;采取MTT比色法檢測心肌細(xì)胞存活率，美國Beckman生化自動分析儀測定LDH活性。        1.5統(tǒng)計分析        采用統(tǒng)計軟件SAS8.0進(jìn)行方差齊性檢驗、方差分析(ANOVA)，以P<0.05為差異有顯著性。        2結(jié) 果

17、        2.1各處理組心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷后細(xì)胞搏動的變化        正常對照組心肌細(xì)胞搏動頻率(99±3)次·min-1相對恒定，節(jié)律規(guī)則;與正常對照組相比，缺氧/復(fù)氧組(13±3)次·min-1差異有顯著性(P<0.05)，表現(xiàn)為搏動頻率減慢、搏動幅度減弱、節(jié)律不齊，有部分停搏，部分細(xì)胞搏動幅度強(qiáng)弱不等;而正常對照組與APC組(84±6)次·min-1、T

18、MPZ(85±        3)次·min-1組相比，兩組心肌細(xì)胞搏動頻率差異均有顯著性(P<0.05);APC組與TMPZ組之間差異無顯著性(P>0.05),見表1。        2.2處理組的心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷后細(xì)胞存活率的變化        缺氧/復(fù)氧組心肌細(xì)胞嚴(yán)重受損，細(xì)胞存活率較正常對照組降低52.79%(P&

19、lt;0.05 );APC組、TMPZ組之間差異無顯著性(P>0.05);APC組、TMPZ與缺氧/復(fù)氧組相比細(xì)胞存活率分別升高47.53%和44.32%(P<0.05)，見表1。        2.3各組心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧組損傷后心肌細(xì)胞懸液中LDH活性的影響        缺氧/復(fù)氧組(36.73±2.35) U·L-1細(xì)胞懸液中LDH增加10倍(P<0.05); APC組(5.70±

20、0.63) U·L-1、TMPZ組(5.74±0.34) U·L-1與缺氧/復(fù)氧組比較細(xì)胞懸液中的LDH活性均低(P<0.05);而APC組、TMPZ組之間差異無顯著性(P>0.05)，見表1。        表1缺氧/復(fù)氧組與其他各處理組心肌細(xì)胞搏動頻率的變化    略        3討 論     &

21、#160;  Yamashita 4 等1992 年首次在犬的試驗中發(fā)現(xiàn)了IPC后24 h再度出現(xiàn)心肌保護(hù)現(xiàn)象，隨后預(yù)處理的延遲保護(hù)作用在鼠5、豬6等哺乳動物中獲得證實。由于DP保護(hù)作用廣、持續(xù)時間長具有更大的臨床應(yīng)用價值。近年興起的心肌保護(hù)的熱門課題通過藥物激發(fā)機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)(腺苷、緩激肽、降鈣素基因相關(guān)肽、PGI2、NO等)的產(chǎn)生或用藥物模擬機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)從而啟動IPC，達(dá)到保護(hù)心臟的作用。藥物預(yù)處理研究取得了一定的進(jìn)展，但迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)理想的預(yù)處理藥物。目前預(yù)處理藥物主要有化學(xué)合成藥物和中藥兩類。在眾多的化學(xué)合成藥物中有腺苷受體激動劑、PKC活性誘導(dǎo)劑、KATP+通

22、道促開放劑等，因存在產(chǎn)生耐受性，具有明顯的致癌性5和選擇性低產(chǎn)生多種不良反應(yīng)6的缺點(diǎn)而無法推廣應(yīng)用;中你正在瀏覽的臨床醫(yī)學(xué)論文是基于川芎嗪預(yù)處理對心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷延遲保護(hù)作用分析            醫(yī)是我國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，中藥具有效果明顯，毒副作用小，價格低廉等優(yōu)點(diǎn)，成為心肌保護(hù)預(yù)處理的熱點(diǎn)。        川芎嗪是中藥川芎的主要有效成份，已有研究表明TMPZ具有抑制血小板聚集、抑制鈣通道

23、、影響NOS基因表達(dá)、擴(kuò)張冠狀動脈，對抗心肌缺血再灌注損傷的作用7-9。心肌缺血再灌注(MIR)可誘導(dǎo)終末分化的心肌細(xì)胞高表達(dá)FOS蛋白及發(fā)生細(xì)胞凋亡，應(yīng)用TMPZ可使缺血心肌細(xì)胞cfos基本表達(dá)減弱及凋亡減輕10,表明TMPZ對MIR誘導(dǎo)的缺血心肌FOS蛋白的表達(dá)及MIR導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的發(fā)生有一定的抑制作用。本實驗在原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧組模型上，用TMPZ預(yù)處理24 h和IPC比較，觀察TMPZ是否與IPC一樣能對抗其后的缺氧/復(fù)氧組損傷。結(jié)果表明，各處理組進(jìn)行缺氧/復(fù)氧組損傷后，只有缺氧/復(fù)氧組的細(xì)胞搏動頻率減慢、搏動幅度減弱、節(jié)律不齊，有部分停搏等，細(xì)胞存活率顯著降低，LDH

24、顯著升高，而TMPZ預(yù)處理組均能明顯提高缺氧/復(fù)氧組損傷后細(xì)胞搏動頻率、細(xì)胞存活率，減少LDH的漏出，能達(dá)到與IPC的效果，證實TMPZ有對抗缺氧/復(fù)氧組造成心肌細(xì)胞損傷的IPC保護(hù)作用。        【參考文獻(xiàn)】        1 MURRY C E, JENNINGS R B, REIMER KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in is

25、chemic myocardiumJ. Circulation,1986, 74: 1124-1136.        2 LI Y J,XIAO Z S, PENG C F. Calcitoningenerelated peptideinduced preconditioning protects against ischemiareperfusion injury in isolated rat heartsJ. Eur J Pharmacol,1996,311:163-167.  

26、0;     3SPECTOR D L, GOLDAM R D, LEINWAND L A. Cells: A laboratory mannul. volum 1:culture and biochemical annlysis of cellJ. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998, 111-119.        4YAMASHITA N, KUZUYA T, HOSHIDA S, et al. Relationship between time interval from preconditioning to sustained ischemia and its effect on limiting infarct sizeJ. Mol Cell, 1992, 24: 150.    &