實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的研究與應(yīng)用

1、文獻(xiàn)綜述實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的研究與應(yīng)用1引言實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)，它是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染性、具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域1。2實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理FQ-PCR是通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)

2、物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量及定性分析。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可分為3個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無(wú)線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。只有

3、在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，它具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、PCR污染少、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。3實(shí)時(shí)熒光PCR的分類(lèi)實(shí)時(shí)熒光PCR是在擴(kuò)增產(chǎn)物聚集的過(guò)程中連續(xù)檢測(cè)，即實(shí)時(shí)檢測(cè)，根據(jù)在指數(shù)擴(kuò)增期的產(chǎn)物量來(lái)推算初始模板的拷貝數(shù)2。實(shí)時(shí)熒光定量PCR包括探針類(lèi)和染料類(lèi)兩種，探針類(lèi)是利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。染料類(lèi)如SYBR Green I則是利用與雙鏈DNA小溝結(jié)合發(fā)光的理化特征指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。前者由于增加了探針的識(shí)別步驟特異性更高，但后者則簡(jiǎn)便易行、成本較低。3.1熒光

4、標(biāo)記探針按其基團(tuán)標(biāo)記和能量轉(zhuǎn)移的方式，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出幾種相關(guān)的技術(shù)，大體可以分為水解探針和雜交探針兩類(lèi)。如Taq ManTM探針(水解探針)、Dual-oligo FRET pairs(雙雜交針)、Universal probe libraryLNA(locked nucleic acids(水解探針)、Lux (light upon extention雜交探 1針)、Simpleproble探針等3。3.2雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合染料目前用于實(shí)時(shí)PCR的dsDNA結(jié)合染料，主要有SYBR Green I和LC Green TMI4。 4實(shí)時(shí)熒光PCR的定量方法在實(shí)時(shí)熒光PCR中，模板的定

5、量有兩種方法：絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量指用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)推算未知的樣本量；相對(duì)定量指在一定樣品中靶序列相對(duì)于另一參照序列的量的變化。由于每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，利用已知起始DNA濃度的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。4.1絕對(duì)定量絕對(duì)定量FQ-PCR一般采用外標(biāo)準(zhǔn)品定量的制備來(lái)實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，可以通過(guò)化學(xué)合成目的基因；或是將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接梯度稀釋?zhuān)换蚴菍CR產(chǎn)物克隆到載體上，然后抽提出質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)測(cè)量濃度和拷貝數(shù)可準(zhǔn)確定量，它的優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定、準(zhǔn)確5。質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)錄的RNA常作為絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度的樣品，并作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷

6、貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)未知樣品進(jìn)行定量時(shí)，根據(jù)未知樣品的Ct值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中定出樣品的拷貝數(shù)。做好標(biāo)準(zhǔn)曲線至關(guān)重要，對(duì)于RNA樣品,標(biāo)準(zhǔn)品最好是體外轉(zhuǎn)錄的RNA，如果用cDNA、PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品，雖然制備簡(jiǎn)單易于保存，但是將會(huì)因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品無(wú)法準(zhǔn)確指示樣品反轉(zhuǎn)錄效率，而給最終定量起始拷貝數(shù)帶來(lái)影響。絕對(duì)定量也具有相應(yīng)的缺陷，標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定保存很難獲得成功。目前廣泛使用的在260nm波長(zhǎng)下定量的方法與眾多因素有關(guān)，如水、緩沖液、儀器性能，乃至于核酸的抽提過(guò)程都會(huì)影響到結(jié)果的穩(wěn)定性。4.2相對(duì)定量相對(duì)定量是指在測(cè)定目的基因的同時(shí)測(cè)定某一內(nèi)源性管家基因，該管

7、家基因主要是用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較、反映反應(yīng)體系內(nèi)是否存在PCR擴(kuò)增的影響因素,通常選用的管家基因有GAPDH、-2微球蛋白和rRNA6。使用的-actin、相對(duì)定量較為早期的方法是用一系列已知外參物做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線得到目的基因和管家基因的量，再將目的基因同管家基因的比值作為定量的最后結(jié)果。此種方法計(jì)算出未知樣品的量是相對(duì)于某個(gè)參照物的量而言，因此，相對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較容易制備，對(duì)于所用的標(biāo)準(zhǔn)品只需知道其稀釋度即可。在整個(gè)試驗(yàn)中，待測(cè)樣品的量來(lái)自于標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終必須除以參照基因的量，即參照基因是1×的樣本，其他的樣本為參照基因的n倍。由于管家基因在各種組織中的恒定表達(dá)，

8、所以可用管家基量來(lái)作為標(biāo)準(zhǔn)，以比較來(lái)源不同的樣本，目的基因表達(dá)量的差異，此即相對(duì)定量。這一方法的缺陷是要求外參、目的基因和管家基因的擴(kuò)增效率一致；此外加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)相當(dāng)于是進(jìn)行雙重PCR反應(yīng),存在兩種模板相互的干擾和競(jìng)爭(zhēng)7。4.3比較Ct值法即CT值法，該方法是同時(shí)擴(kuò)增待測(cè)靶基因片段和一個(gè)作為內(nèi)參照的基因片段，一般是一個(gè)內(nèi)源性管家基因片段。這兩個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)可在2管中分別進(jìn)行；也可在同一反應(yīng)管中進(jìn)行，測(cè)得兩者的CT值之差，即CT。該方法不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線。它是根據(jù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的原理，假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加倍的產(chǎn)物數(shù)量PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到擴(kuò)增產(chǎn)物的值來(lái)反映起始模板的量通過(guò)數(shù)學(xué)公式來(lái)計(jì)算相對(duì)量。比

9、較Ct法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對(duì)定量的不同之處在于其運(yùn)用了數(shù)學(xué)公式來(lái)計(jì)算相對(duì)量,前提是假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)量，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到Ct值來(lái)反應(yīng)起始模板的量，一個(gè)循環(huán)(Ct=1)的不同相當(dāng)于起始模板數(shù)2倍的差異。比較不同待測(cè)標(biāo)本DNA的CT值與正常標(biāo)本DNA的CT值的變化，即可對(duì)未知標(biāo)本靶基因的原始拷貝數(shù)作出判斷，從而對(duì)病理狀態(tài)進(jìn)行判斷或診斷。但是此方法是以靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率基本一致為前提的，效率的偏移將影響實(shí)際拷貝數(shù)的估計(jì)8。最終結(jié)果也是靶序列和參考品的相對(duì)比值。該方法需確定靶序列和參考品的擴(kuò)增效率是否一致；如不一致，則會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。5實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PC

10、R技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床及生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域中。在科研方面可定量分析各種基因的表達(dá)分析，基因突變和多態(tài)性分析，單核苷酸多態(tài)SNP測(cè)定及易位基因的檢測(cè)；在醫(yī)療方面可用于免疫組化分析、臨床疾病早期診斷、病原體檢測(cè)、耐藥性分析、腫瘤微小殘留病變研究等9。以下就其在基因工程研究、病原體的檢測(cè)和腫瘤分子診斷等方面的應(yīng)用及其新進(jìn)展作一簡(jiǎn)述。5.1基因工程研究領(lǐng)域?qū)崟r(shí)熒光定量技術(shù)的出現(xiàn)不僅加強(qiáng)了有關(guān)對(duì)基因的量的研究方法，而且也加強(qiáng)了對(duì)基因的質(zhì)所發(fā)生變化的研究。它可以檢測(cè)基因突變和基因組的不穩(wěn)定性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于遺傳分析10。有不同的熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的探針?lè)謩e與野生型和突變基因雜交，探針雜交的效率和其后的

11、切除與雜交有關(guān)。如果一種染料的熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于另一種，說(shuō)明它是一個(gè)純合子，如果熒光信號(hào)都增加則表明是一個(gè)雜合子。劉敬忠等報(bào)道使用dsDNA結(jié)合染料SYBR Green I，結(jié)合融解曲線分析對(duì)-地中海貧血純合子、雜合子作出診斷11。使用雙色熒光標(biāo)記探針，結(jié)合不同的引物設(shè)計(jì)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)某些先天性疾病的定量檢測(cè)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)地中海貧血癥(地貧)患者與珠蛋白mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確，為了解地貧的分子病理機(jī)制及其臨床診斷提供了可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)。迄今對(duì)遺傳性物質(zhì)改變引起的疾病還無(wú)法根治，只能通過(guò)產(chǎn)前監(jiān)測(cè)和產(chǎn)前基因診斷，減少病嬰出生。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可用于產(chǎn)前

12、監(jiān)測(cè)和產(chǎn)前基因診斷。實(shí)時(shí)熒光定量PCR一個(gè)誘人的應(yīng)用前景是用于檢測(cè)基因突變和基因組的不穩(wěn)定性?；蛲蛔兊臋z測(cè)基于兩條探針，一條探針橫跨突變位點(diǎn)，另一條為錨定探針，與無(wú)突變位點(diǎn)的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記，如靶序列中無(wú)突變，探針雜交便完全配對(duì)，如有突變，則探針與靶序列不完全配對(duì)，會(huì)降低雜交體的穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度(Tm)，這樣便可對(duì)突變和多態(tài)性進(jìn)行分析。Tesson等確定了實(shí)時(shí)定量PCR的技術(shù)條件，利用兩種發(fā)光探針及適當(dāng)?shù)难h(huán)域值，擴(kuò)增一個(gè)轉(zhuǎn)移后的基因和一個(gè)對(duì)照基因，以分析轉(zhuǎn)基因鼠的接合性12。同型結(jié)合的和異質(zhì)接合的動(dòng)物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，通

13、過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，該方法為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的同型結(jié)合及異質(zhì)接合提供了明確的鑒定結(jié)果。這項(xiàng)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中將有很大用途。5.2腫瘤的分子診斷腫瘤的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生了變化，是一種多基因異常的疾病,這些異常變化用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法都可以檢測(cè)出來(lái)。目前用此方法進(jìn)行過(guò)端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病ER基因、腫瘤MDR1基因等，盡管腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制尚未完全闡明，但相關(guān)基因的遺傳學(xué)改變的積累是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因之一已得到普遍承認(rèn)。癌因的突變和表達(dá)增加,在許多腫瘤早期就出現(xiàn)。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)不僅能有效地檢測(cè)到基因的突變，而且可以準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因的表達(dá)量。如定量結(jié)

14、直腸癌淋巴結(jié)的癌胚抗原(CEA)mRNA的表達(dá)量，可作為診斷癌癥微轉(zhuǎn)移的重要依據(jù)。目前，腫瘤患者的生存期已有所延長(zhǎng)，但是緩解期的患者仍存在復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)，因此，微小殘留病變的檢測(cè)對(duì)于進(jìn)一步調(diào)整治療方案至關(guān)重要。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)正成為檢測(cè)腫瘤微小殘留分子標(biāo)志的一種必備工具。Eckert等提出采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病微殘留病灶，對(duì)兒童急性白血病的治療有重要指導(dǎo)意義。5.3病原體的分子檢測(cè)目前，用此方法還進(jìn)行了對(duì)人類(lèi)結(jié)核桿菌、免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒等病原體的檢測(cè)。同樣在國(guó)內(nèi)，2004年針對(duì)Sars流行性病的檢測(cè)和診斷使得熒光定量PCR技術(shù)得以應(yīng)用

15、和發(fā)展。熒光定量PCR問(wèn)世后的幾年中，積累了大量有關(guān)病原體核酸量與感染性疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后之間關(guān)系的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。目前，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)已應(yīng)用于肝病、性病以及人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)等各種病原體的臨床診斷，為實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確診斷提供了有效的檢測(cè)方法。6前景展望自FQ-PCR方法建立以來(lái)，已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、疾病診斷、食品、水質(zhì)環(huán)保、藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域，目前FQ-PCR的應(yīng)用主要集中在病原體檢測(cè)及鑒定方面。FQ-PCR技術(shù)與傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比具有明顯優(yōu)勢(shì)，但也有不足之處：不能監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。各實(shí)驗(yàn)室所用的生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品各不相同，致

16、使試驗(yàn)結(jié)果缺乏可比性。技術(shù)設(shè)備要求較高，熒光探針價(jià)格昂貴。雖然FQ-PCR技術(shù)仍存在這些尚需改進(jìn)的地方，但隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，儀器設(shè)備和試劑費(fèi)用的降低及相關(guān)知識(shí)的了解和普及FQ-PCR將成為未來(lái)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必備的研究工具，在生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)⒌玫礁訌V泛的應(yīng)用。參考文獻(xiàn)1 Mikael KA, Jose MA, Martin B, et al. The real-time polymerase chain reactionJ. Molecular Aspects of Medicine, 2006, 27:95-125.2 Jones CD, Yeung C, Zehnder JL, et

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