用熒光分光光度法測(cè)定中藥配方顆粒對(duì)自由基的清除作用

1、用熒光分光光度法測(cè)定中藥配方顆粒對(duì)自由基的清除作用Measure the Ability of Eliminating the Free Radical by the Prescription Granule of Chinese Traditional Medicine Using the Fluorometry張承 蔡繼文 *（中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院有機(jī)化學(xué)研究所。廣州510275）摘要 Fe2+EDTA在弱堿性介質(zhì)中可以還原溶解氧，最終生成羥自由基。本實(shí)驗(yàn)用熒光分光光度法測(cè)定了山茱萸等9種市售的中藥配方顆粒對(duì)Fe2+EDTA體系產(chǎn)生的羥基自由基(·OH)的抑制程度

2、，測(cè)定了不同濃度的半支蓮等三種中藥的清除率，并得到了其清除率與其濃度得線性耦合曲線，比較了山茱萸和半支蓮對(duì)自由基的清除的能力。關(guān)鍵詞 中藥；羥基自由基；熒光分光光度Abstract: Fe2+-EDTA system in basic condition can reduce O2 that resolved in water to ·OH. We use the Fluorometry to evaluate the extent that the prescription granule of Chinese traditional medicine such as Fructu

3、s Corni eliminate the ·OH. We measure the eliminating rate of different concentration., and obtain the linear fit curve to the concentration.We also compare the eliminating ability between Fructus Corni and Herba Scutellariae Barbatae.Key words: Chinese traditional medicine, hydroxy free radica

4、l, Fluorometry1 前言自由基是在分子氧、多不飽和鏈脂肪酸巰基化合物、醌類化合物等的反應(yīng)和代謝過(guò)程中產(chǎn)生或衍生出來(lái)的, 是一種外層軌道上含有未配對(duì)電子的原子、原子團(tuán)或呈特殊狀態(tài)的分子。機(jī)體內(nèi)FR大量產(chǎn)生或清除過(guò)緩,使積累超過(guò)臨界水平后,會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷1。·OH是目前已知的化學(xué)性質(zhì)最活潑的一種活性氧分子, 其氧化能力強(qiáng)、壽命短、對(duì)機(jī)體危害大2。自Harman創(chuàng)立衰老的自由基學(xué)說(shuō)3以來(lái)的半個(gè)世紀(jì),人們對(duì)自由基的產(chǎn)生及其對(duì)人體所產(chǎn)生的危害有了越來(lái)越深刻的認(rèn)識(shí), 各種炎癥、癌癥、臟器損傷、老化等都與自由基密切相關(guān), 因而研究抗自由基藥物以保護(hù)機(jī)體, 已是當(dāng)前抗衰老研究工作中所矚

5、目的問(wèn)題之一4。中藥抗氧化劑具有經(jīng)濟(jì)和毒、副作用小等明顯的優(yōu)點(diǎn), 在中草藥中, 有許多藥物都對(duì)自由基有清除作用4。中藥配方顆粒品質(zhì)優(yōu)良，效果客觀，使用簡(jiǎn)便快捷，必將成為21世紀(jì)中醫(yī)藥配方的主流5。因此研究它的藥性有著重要的意義。當(dāng)前對(duì)中藥的提取物的清除自由基研究已經(jīng)比較多。而對(duì)使用的越來(lái)越廣泛的中藥配方顆粒清除自由基的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用了市售的中藥顆粒配方進(jìn)行研究。測(cè)定清除自由基的方法6有電子自旋共振法7，化學(xué)發(fā)光法8，紫外分光光度法9，熒光分光光度法等10。本實(shí)驗(yàn)采用熒光分光光度法進(jìn)行測(cè)定，其儀器簡(jiǎn)單、操作方便，廣泛用于檢測(cè)中藥消除自由基性能的實(shí)驗(yàn)中。2 實(shí)驗(yàn)部分102.1實(shí)驗(yàn)原理Fe

6、2+EDTA 在弱堿性介質(zhì)中還原溶解氧生成超氧陰離子自由基(O2-·) ,O2-·進(jìn)一步歧化為H2O2和氧分子,之后Fe2+EDTA 與H2O2反應(yīng)生成羥基自由基(·OH).·OH進(jìn)攻對(duì)苯二甲酸產(chǎn)生唯一的強(qiáng)熒光羥基化產(chǎn)物2羥基對(duì)苯二甲酸(HOTP)。·OH清除劑加入體系后，與對(duì)苯二甲酸競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合·OH ,導(dǎo)致對(duì)苯二甲酸的羥基化產(chǎn)物HOTP 的生成量減少，從而使體系熒光強(qiáng)度明顯降低。2.2 儀器與試劑日本 島津RF-5301PC熒光分光光度計(jì)，激發(fā)波長(zhǎng)316 nm對(duì)苯二甲酸鈉溶液(1.0×10-4 mol/ L); Fe2+(

7、硫酸亞鐵溶液,1.0×10- 3 mol/ L)； EDTA(1.0×10- 3 mol/ L)；磷酸鈉緩沖溶液(0.2 mol/ L ;pH =7.4)。中藥配方顆粒購(gòu)于中山附屬第一醫(yī)院大藥房和廣州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院。2.3 實(shí)驗(yàn)方法在10 mL刻度試管中依次加入1.0×10- 4 mol/ L 對(duì)苯二甲酸液0.50 mL,1.0×10- 3 mol/L EDTA 溶液0.3 mL ,1.0 ×10- 3 mol/ L Fe2 + 溶液0.30 mL,0.2 mol/ L pH 7. 4 的磷酸鈉緩沖液2. 00 mL,用水稀釋至10.0 m

8、L,反應(yīng)6 min后測(cè)定體系熒光強(qiáng)度。測(cè)量中藥的清除率時(shí)在加入Fe2+之前加入一定體積的中藥溶液。3 結(jié)果與討論3.1 從fig 1可以看出, Fe2EDTA 在弱堿性介質(zhì)中還原溶解氧的最終物·OH 進(jìn)攻對(duì)苯二甲酸產(chǎn)生強(qiáng)熒光產(chǎn)物HOTP(曲線1) ，其峰值位置為426 nm; 而當(dāng)溶液中不存在·OH(曲線3) 或?qū)Ρ蕉姿徕c(曲線2)時(shí),體系不產(chǎn)生熒光. 由此可見(jiàn),是對(duì)苯二甲酸的羥基化反應(yīng)產(chǎn)生熒光.，自由基或者是對(duì)苯二甲酸本身不產(chǎn)生熒光。3.2 由tabel 1可以看出這幾種中藥對(duì)自由基都有抑制作用。下面所提到的熒光強(qiáng)度都是指在426 nm處的熒光強(qiáng)度。3.3 Table

9、2可以看出：半支蓮對(duì)羥自由基有抑制作用。在低濃度范圍內(nèi)，體系半支蓮濃度小于0.01g/L時(shí)，半支蓮的濃度與其對(duì)·OH的抑制程度基本符合正比關(guān)系。山茱萸對(duì)羥自由基有抑制作用。在實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，其濃度與其對(duì)·OH的抑制程度符合正比關(guān)系,且濃度對(duì)其清除自由基能力影響較為明顯。在較高濃度時(shí)，山茱萸比半支蓮有更好的清除效果,在較低濃度時(shí)則相反。3.4 由table 3可以看出，隨著混合物中山茱萸的增加，其清除率提高，這進(jìn)一步說(shuō)明了山茱萸的清除自由基的效果要好于半支蓮。與等濃度的單獨(dú)中藥的清除率相比，在誤差范圍內(nèi)可以說(shuō)沒(méi)有明顯的提高或降低，也就是說(shuō)，這兩種中藥混合沒(méi)有明顯的協(xié)同或負(fù)協(xié)

10、同效應(yīng)。3.5 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，由于熒光的靈敏度很高，受天氣，溫度等影響較大，加上所用容器不是太精確，因此重現(xiàn)性一般，通過(guò)多次重復(fù)性操作可使其出現(xiàn)的系統(tǒng)誤差盡量減小。321fig 1：體系熒光發(fā)射光譜圖1. 對(duì)苯二甲酸1. 0×10- 5 mol/ L + Fe ( II) 3. 0 ×10- 5 mol/ L + EDTA3. 0 ×10- 5 mol/ L2. 與1 相比,體系中沒(méi)有加入對(duì)苯二甲酸鈉3. 與1 相比,體系中沒(méi)有加入Fe ( II)Table 1：不同中藥對(duì)自由基的清除率中藥名中藥自身熒光強(qiáng)度F加入中藥后熒光強(qiáng)度F清除率（）F0-(F- F)/

11、F0黃芩63.803154.98474.1紅花109.52241.01662.6桂枝83.272211.28463.6地龍88.537233.33858.8柴胡87.727231.92359.0豬苓59.979217.03555.3其清除率可以表示為：F0-(F- F)/F0 其中F0=351.739，為不加入中藥時(shí)體系熒光強(qiáng)度，F(xiàn)表示中藥自身的熒光強(qiáng)度。F表示加入中藥后體系的熒光強(qiáng)度。Table 2: 三種中藥對(duì)體系自由基的清除率結(jié)果茶多酚半支蓮山茱萸濃度/g/lF清除率/%濃度/g/lF清除率/%濃度/g/lF清除率/%0.10189.52273.60.10120.34746.70.102

12、00.56877.90.08175.41468.10.08131.27951.00.06189.96973.80.06159.12261.80.06118.91646.20.04170.45566.20.04143.71255.80.04129.93950.50.02141.3254.90.02126.28749.00.01103.52240.20.0193.32436.20.008113.64744.10.00886.86333.70006100.5639.00.00685.96233.40.00497.46837.80.00480.4731.20.00288.48434.40.00273.

13、50828.5其清除率可以表示為：(F0-F)/F0 其中F0=257.251斜率：15.2572相關(guān)系數(shù)：0.97381斜率：3.07105相關(guān)系數(shù)：0.999fig 2：茶多酚對(duì)羥基自由基的清除曲線 fig 3：半支蓮對(duì)羥基自由基的清除曲線需要指出的是茶多酚的清除率只能作為相對(duì)值和自身不同的濃度相比較，而不能作為絕對(duì)值和別的物質(zhì)比較，因?yàn)椴瓒喾幼陨淼陌l(fā)射光譜在426 nm處有一定的熒光強(qiáng)度斜率：8.93616相關(guān)系數(shù)：0.97788fig 4：山茱萸對(duì)羥基自由基的清除曲線Table 3: 山茱萸和半支蓮水溶液的混合物對(duì)自由基的清除率混合比例（半支蓮：山茱萸）體系熒光強(qiáng)度FF清除率（）F0-

14、(F- F)/F041157.217100.30438.932169.33288.18934.223167.57689.94534.914154.540102.98139.9參 考 文 獻(xiàn)l楊先虎，中藥抗自由基毒性作用淺述，基層中藥雜志，2002，16(3)：49-502孫存普，張建中，段紹瑾，自由基生物學(xué)導(dǎo)論M，合肥：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社，19993D. Harman. Univ. California Radiation Laboratory Report，1955, 3078: July 144彭昕，聶理，徐朗萊，中藥對(duì)自由基清除作用的進(jìn)展，基層中藥雜志，2002，16(1):：485

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