逆流色譜的技術(shù)-2013.

1、逆流色譜技術(shù)與應(yīng)用主講: 魏蕓*逆流色譜定義、特點(diǎn)*逆流色譜技術(shù)的歷史*逆流色譜的原理*逆流色譜儀器*逆流色譜分離實(shí)施操作*逆流色譜技術(shù)新進(jìn)展*逆流色譜的應(yīng)用舉例*逆流色譜的發(fā)展前景什么是逆流色譜？ 逆流色譜 （Counter-Current Chromatography，CCC）是一種基于多級(jí)逆流液液萃取的分析及制備色譜。溶質(zhì)依靠在離心力場(chǎng)下空心螺旋管中逆向流動(dòng)的兩個(gè)不相混溶液體間溶質(zhì)分配系數(shù)的不同而實(shí)現(xiàn)分離。得到的譜圖通常是一些各溶質(zhì)相互分離的譜峰。這種色譜不需要通常色譜中的固體固定相。用保留于空心管內(nèi)的一相作固定相，另一相液體作流動(dòng)相。逆流色譜的特點(diǎn)逆流色譜的特點(diǎn)不用任何固態(tài)支持體，實(shí)現(xiàn)

2、純粹的高效液-液分配分離。*完全排除支持體對(duì)樣品的不可逆吸附、沾染、失活、變性等影響。*節(jié)省材料和溶劑。*能實(shí)現(xiàn)較大制備量的高純度物質(zhì)分離純化。逆流色譜技術(shù)的歷史1950s逆流分溶法Countercurrent Distribution （CCD）1960s液滴逆流色譜Droplet Countercurrent Chromatography (DCCC)1966Ito赴美國(guó)NIH開發(fā)螺旋管逆流色譜技術(shù)1970s建立Coil Planet Contrifuge（CPC）實(shí)現(xiàn)逆流色譜技術(shù)的基本模型。并應(yīng)用于抗生素、肽、氨基酸等類物質(zhì)的分離。1980s發(fā)明正交軸CCC，高速逆流色譜（HSCCC）小

3、量分析型HSCCC等原型。1990sHSCCC技術(shù)在世界范圍內(nèi)傳播，J. C., J. L. C. 連續(xù)出版多次專輯。1995建立pH區(qū)帶CCC體系，F(xiàn)DA用來制備有機(jī)染料標(biāo)準(zhǔn)樣品。1995美國(guó)化學(xué)會(huì)出版Modern CCC一書1996美國(guó)John Wiley & Sons Co.出版HSCCC一書。被選編為分析化學(xué)叢書132卷。20009月在英國(guó)Brunel大學(xué)召開第一屆國(guó)際CCC技術(shù)學(xué)術(shù)會(huì)議CCC2000。并決定CCC2002在中國(guó)召開。十卷巨著Encyclopedia of Separation Science（分離科學(xué)百科叢書）由Academic Pree Ltd（英國(guó)科學(xué)出版

4、社）出版發(fā)行。2000年我國(guó)張教授應(yīng)邀撰寫了關(guān)于HSCCC分離天然產(chǎn)物中生物堿、黃酮等類物質(zhì)的條目。逆流色譜的原理Principle of CCC 單向性流體動(dòng)力學(xué)平衡理論單向性流體動(dòng)力學(xué)平衡理論高速逆流色譜的單向流體動(dòng)力平衡機(jī)理高速逆流色譜的單向流體動(dòng)力平衡機(jī)理 J J型行星式運(yùn)動(dòng)螺旋管內(nèi)兩相溶劑混合和移動(dòng)型行星式運(yùn)動(dòng)螺旋管內(nèi)兩相溶劑混合和移動(dòng) 逆流色譜有什么優(yōu)點(diǎn)？一、沒有固體載體空心管代替了填料柱；相應(yīng)地，溶劑體系選擇代替了分離柱選擇。由于不用固體支撐體，避免了樣品在分離過程的不可逆吸附、分解等可能的樣品變性問題二、收率高理論收率為 100滯留在柱中的樣品可以通過多種洗脫方式予以完全回收三

5、、高效能單個(gè)物質(zhì)的基線分離粗樣可以直接上樣而不會(huì)對(duì)柱子造成任何損害；柱子可以用合適的溶劑（如甲醇）很容易地清洗，然后注入新的溶劑后構(gòu)成新的柱體，重復(fù)使用。四、工作條件溫和基本上是常溫低壓（液體定量泵的壓力）的液相操作五、用途廣，適應(yīng)能力強(qiáng)原則上，凡能進(jìn)行萃取分離的體系，都能用逆流色譜法分離幾乎任何互不相溶的兩相溶劑系統(tǒng)都可以使用，只是有的溶劑體系可能在一些特殊型號(hào)的HSCCC儀器上可以取得更好的分離效果。因此，可以通過改變?nèi)軇w系的極性，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同極性物質(zhì)的分離。六、有制備能力全球科學(xué)工作者正為之努力；已有幾個(gè)方案；已有樣機(jī)，可達(dá)工業(yè)規(guī)模；近兩年更加完善。逆流色譜的能力如何？按規(guī)模大小可分為三

6、 種 類 型1、分 析 型320分鐘給出全譜2、半 制 備 型 轉(zhuǎn)鼓容量200300毫升。每輪操作能給出產(chǎn)品5100毫克，適于克量級(jí)制備。3、制 備 型公斤級(jí)或公斤級(jí)以上的制備。 高速逆流色譜分離實(shí)施操作高速逆流色譜分離實(shí)施操作SampleInjectorMultilayerCoil PlanetCentrifugeDetectorPump SolventReservoirFractionCollectorRecorderor PCHPLC,TLCMS, NMR AnalysisHSCCC Separation SystemUV, ELSD, MSHSCCC Separation System

7、1. 溶劑系統(tǒng)的準(zhǔn)備溶劑系統(tǒng)的準(zhǔn)備HSCCC分離的溶劑系統(tǒng)，應(yīng)該滿足以下要求：l 不造成樣品的分解與變性；l 足夠高的樣品溶解度；l 樣品在系統(tǒng)中合適的分配系數(shù)值；l 固定相能實(shí)現(xiàn)足夠高的保留。 高速逆流色譜常用基本溶劑體系高速逆流色譜常用基本溶劑體系 高速逆流色譜常用基本溶劑體系 被分離物質(zhì)種類 基本兩相溶劑系統(tǒng) 輔助溶劑 非極性或弱極性物質(zhì) 正庚(己)烷甲醇 正庚(己)烷乙腈 正庚(己)烷甲醇(或乙腈)水 氯烷烴 氯烷烴 中等極性物質(zhì) 氯仿水 乙酸乙酯水 甲醇，正丙醇，異丙醇 正己烷，甲醇，正丁醇 極性物質(zhì) 正丁醇水 甲醇，乙酸 溶劑體系的平衡溶劑體系的平衡 充分地混和和靜置 使用前脫氣

8、封閉的容器來儲(chǔ)存 2. 柱系統(tǒng)的準(zhǔn)備柱系統(tǒng)的準(zhǔn)備 首先在儀器不旋轉(zhuǎn)的狀態(tài)下，以較高的流速將固定相注入螺旋管柱內(nèi)；此時(shí)可同時(shí)開啟檢測(cè)器預(yù)熱； 注滿固定相后，停泵。然后使儀器以選定的轉(zhuǎn)速開始轉(zhuǎn)動(dòng)； 將流動(dòng)相以合適的流速泵入柱內(nèi)，直到流動(dòng)相開始流出，此時(shí)說明柱體系已達(dá)到平衡； 當(dāng)一切包括檢測(cè)器基線都穩(wěn)定時(shí)，該柱系統(tǒng)即準(zhǔn)備就緒，可以進(jìn)樣了。3. 樣品溶液的準(zhǔn)備和進(jìn)樣樣品溶液的準(zhǔn)備和進(jìn)樣 樣品混合物可溶解在分離所用的溶劑體系中制備成樣品溶液。當(dāng)樣品量較小時(shí)，可以將樣品溶解在流動(dòng)相中。當(dāng)樣品量較大時(shí)，可以將樣品溶解在相同體積的上相和下相中。 逆流色譜對(duì)樣品的要求不高，甚至允許有懸浮物的樣品溶液進(jìn)入；進(jìn)樣體

9、積可以達(dá)到柱體積的1015。 4. 洗脫方式洗脫方式 等比例洗脫等比例洗脫 階躍梯度洗脫階躍梯度洗脫 梯度洗脫梯度洗脫 雙向洗脫雙向洗脫 清洗柱體清洗柱體5. 檢測(cè)器檢測(cè)器 紫外-可見光檢測(cè)器（UV-VIS） 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD） 質(zhì)譜檢測(cè)器(MSD) 逆流色譜技術(shù)的新發(fā)展逆流色譜技術(shù)的新發(fā)展CCC New Development Chromatogram of the crude ethanol extract of Rheum officinals Baill by analytical HSCCC. Solvent system: A. n-hexane-ethyl acetat

10、e-methanol-water (9:1:5:5, v/v/v/v); B. n-hexane-ethyl acetate-methanol-water (1:1:1:1, v/v/v/v); C. n- hexane-ethyl acetate-methanol-water (3:7:5:5, v/v/v/v); stationary phase: upper organic phase; mobile phase: lower aqueous phase; flow-rate: 1.0 ml/min; revolution speed: 1800rpm; sample: 15mg dis

11、solved in 1.0 ml lower phase. Peak 2 of A, B and C contains rhein. HPLC conditions: Supelcosil ODS column (250 x 4.6 mm I.D.), column temperature: 35C. Mobile phase: methanol: 0.5% H3PO4 (60:40, v/v), flow-rate: 1.0 ml/min monitored at 254nm by a PAD detector. 分析型高速逆流色譜法分離大黃粗提物中大黃酸Chromatogram of th

12、e crude ethanol extract from Rheum officinaleBaill by multidimensional countercurrent chromatography(MDCCC). Solvent system: n- hexane-ethyl acetate-methanol-water (3:7:5:5, v/v/v/v); stationary phase: upper organic phase;mobile phase: lower aqueous phase; flow-rate: 2.0 ml/min;revolution speed: 800

13、rpm; sample: 500 mg dissolved in 20 ml oflower phase. A. Chromatogram obtained by HSCCC 1 (Peak 2 ofFig. 4A contains rhein). B. Chromatogram of the cut fraction (theshaded part of the peak 2 in Fig.4 A) obtained by HSCCC 2. HPLCconditions: Supelcosil ODS column (250 x 4.6 mm I.D.), columntemperature

14、: 35C. Mobile phase: methanol: 0.5% H3PO4 (60:40,v/v), flow-rate: 1.0 ml/min monitored at 254nm by a PAD detector.柱多維高速逆流色譜法分離大黃粗提物中大黃酸雙水相逆流色譜體系3.Brief introduction of the 3.Brief introduction of the programprogramCCC2002 Beijing CHINACCC2002 Beijing CHINA離心沉降色譜Centrifugal Precipitation Chromatograp

15、hy逆流色譜應(yīng)用舉例逆流色譜應(yīng)用舉例Applications of CCC標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分離 Y. WEI, 正交軸逆流色譜雙水相溶劑pH對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分離的影響羊肚菌糖蛋白的分離高速逆流色譜法對(duì)天然產(chǎn)物小分子分離純化研究高速逆流色譜法對(duì)天然產(chǎn)物小分子分離純化研究 高速逆流色譜法對(duì)天然產(chǎn)物小分子分離純化高速逆流色譜法對(duì)天然產(chǎn)物小分子分離純化高速逆流色譜法制備高純度單體番茄紅素高速逆流色譜法制備高純度單體番茄紅素 分析型逆流色譜法分離番茄紅素分析型逆流色譜法分離番茄紅素Chromatogram of the crude extract from marigold petal by preparati

16、ve HSCCC. Solvent system: n-hexane-dichloromethane-acetonitrile (10:3.5:6.5/v:v:v); stationary phase: lower phase; mobile phase: upper phase; flow-rate: 1.0 ml/min; revolution speed: 1800 rpm; sample:15 mg dissolved in 1 ml lower phase; retention of the stationary phase: 62.5%. Peak:5. lycopeneY. WE

17、I, 半制備型逆流色譜法分離番茄紅素半制備型逆流色譜法分離番茄紅素Chromatogram of the crude extract from marigold petal by preparative HSCCC. Solvent system: n-hexane-dichloromethane-acetonitrile (10:3.5:6.5/v:v:v); stationary phase: lower phase; mobile phase: upper phase; flow-rate: 2.0 ml/min; revolution speed: 800 rpm; sample:20

18、0 mg dissolved in 20 ml lower phase; retention of the stationary phase: 62.5%. Peak:5. lycopene 高效液相色譜法對(duì)番茄紅素粗提物和高速逆流色譜峰所對(duì)應(yīng)組分進(jìn)行分析高效液相色譜法對(duì)番茄紅素粗提物和高速逆流色譜峰所對(duì)應(yīng)組分進(jìn)行分析 色譜條件為：柱子：Supelcosil ODS, 柱溫30C。流動(dòng)相：乙腈：甲醇：氯仿=47：47：6，V/V/V，流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為472nm和 254nm。 粗提物番茄紅素 高速逆流色譜法對(duì)天然產(chǎn)物小分子分離純化高速逆流色譜法對(duì)天然產(chǎn)物小分子分離純化高速逆

19、流色譜法制備高純度單體葉黃素高速逆流色譜法制備高純度單體葉黃素 分析型逆流色譜法分離葉黃素分析型逆流色譜法分離葉黃素 Chromatogram of the crude extract from marigold petal by analytical HSCCC. Solvent system: a: n-heptane-chloroform-acetonitrile (10:2:8, v/v/v); b: n-heptane-chloroform-acetonitrile (10:3.5:6.5, v/v/v); c: n-heptane-chloroform-acetonitrile (

20、10:3:7, v/v/v); stationary phase: lower phase; mobile phase: upper phase; flow rate: 1.0ml/min; revolution speed: reverse revolution 1800 rpm; sample: 15mg dissolved in 1 ml upper phase; retention of the stationary phase: about 50%. Peak: 2. lutein Y. WEI, 半制備型逆流色譜法分離葉黃素半制備型逆流色譜法分離葉黃素Chromatogram of

21、 the crude extract from marigold petal by preparative HSCCC. Solvent system: n-hexane-chloroform-acetonitrile (10:3:7/v:v:v); stationary phase: lower phase; mobile phase: upper phase; flow-rate: 2.0 ml/min; revolution speed: reverse revolution 800 rpm; sample:300 mg dissolved in 20 ml lower phase; r

22、etention of the stationary phase: 62.5%. Peak:2. lutein高效液相色譜法對(duì)葉黃素粗提物和高速逆流色譜法分離得葉黃素分析高效液相色譜法對(duì)葉黃素粗提物和高速逆流色譜法分離得葉黃素分析 The result of HPLC analysis of the crude extract from marigold petal and Peak 2 (lutein) Shown in Fig.3. (A): the crude sample; (B): peak 2; Column: an Internet ODS column (150 x 4.6 m

23、m I.D.); Column temperature: 30C; The mobile phase composed of A: 100%methanol, B: 100% ethyl acetate was eluted at a flow-rate of 2.0 ml/min using linear gradient over 20 min from 60% methanol to 40% methanol and the effluent monitored at446nm and 254nm by a PAD detector. 粗提物葉黃素 高速逆流色譜法對(duì)天然產(chǎn)物小分子分離純化

24、高速逆流色譜法對(duì)天然產(chǎn)物小分子分離純化高速逆流色譜法制備高純度雷公藤乙素高速逆流色譜法制備高純度雷公藤乙素 OoHOH3COHCHCHCH33OOOFig.1 Chromatogram of tripdiolide from Tripterygium wilfordii Hook by preparative high-speed countercurrent chromatography (HSCCC) Solvent system: n- hexane-dichloromethane-methanol-water (3:22:17:8, v/v/v/v); stationary phase

25、: upper organic phase; mobile phase: lower aqueous phase; flow-rate: 2.0 ml/min; revolution speed: 800rpm; UV 214nm. Sample: 1000 mg dissolved in 20 ml of lower phase 柱多維高速逆流色譜法分離雷公藤粗提物中雷公藤乙素Y. WEI, Fig.2 Chromatogram of tripdiolide from Tripterygium wilfordiiHook by multidimensional countercurrent

26、chromatography(MDCCC)A. Chromatogram obtained by HSCCC 1. Solvent system: n-hexane-ethyl acetate-methanol-water (3:22:17:8, v/v/v/v);stationary phase: upper organic phase; mobile phase: lower aqueousphase; flow-rate: 2.0 ml/min; revolution speed: 800rpm; UV 214nm.Sample: 1000 mg dissolved in 20 ml of lower phase. B.Chromatogram of the cut fraction (the shaded part of the peak 3 inFig.1) obtained by HSCCC 2. Solvent system: chloroform-methano