重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子的搖瓶發(fā)酵研究

1、西北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)網(wǎng)絡(luò)版) 2004年12月，第2卷，第12期Science Journal of Northwest University Online Dec. 2004，Vol.2，No. 12重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子的搖瓶發(fā)酵研究馬 莉，白 泉，王驪麗，斯 琴，耿信篤（西北大學(xué) 現(xiàn)代分離科學(xué)研究所/現(xiàn)代分離科學(xué)陜西省重點實驗室，陜西 西安 710069）摘 要：為了優(yōu)化重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子搖瓶發(fā)酵工藝，利用搖瓶法選擇出最佳的rhGM-CSF的培養(yǎng)條件。結(jié)果表明：最佳條件為培養(yǎng)溫度32，初始pH值7.27.4，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，種子菌齡在OD600為1.

2、0左右時接種，并在對數(shù)生長前期0.50.8之間誘導(dǎo)4 h。在此優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，在搖瓶中使用M9培養(yǎng)基時，rhGM-CSF的表達(dá)量占菌體總蛋白的24.3%，OD600達(dá)5.35，說明構(gòu)建的rhGM-CSF工程菌發(fā)酵的穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，可為rhGM-CSF的大規(guī)模生產(chǎn)提供可靠的放大依據(jù)。關(guān) 鍵 詞：重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；大腸桿菌；搖瓶發(fā)酵中圖分類號：TQ920.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-274X(2004)0117-08人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor, hG

3、M-CSF)是一種重要的造血調(diào)控因子1，對各種原因尤其是癌癥患者化療后引起的白細(xì)胞減少癥有明顯的療效。由于天然人GM-CSF來源有限，產(chǎn)量甚微，不能滿足科研和臨床的需要，1985年Wong等人克隆了人GM-CSF cDNA，并實現(xiàn)了表達(dá)2,1993年張智清等人在國內(nèi)首次克隆了人GM-CSF cDNA，并在大腸桿菌中獲得表達(dá)3。近年來，許多科研人員也致力于這方面的研究，并取得了成功46。本文作者也克隆出了人GM-CSF cDNA，實現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達(dá)。為了進(jìn)一步開發(fā)研究，實現(xiàn)rhGM-CSF的產(chǎn)業(yè)化，本文以提高其表達(dá)量和細(xì)胞產(chǎn)量為目標(biāo)，對重組大腸桿菌的搖瓶培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，確定出最佳生產(chǎn)重

4、組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的培養(yǎng)條件，為以后的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。 1 材料和方法1.1 材 料工程菌：菌種pDH/rhGM-CSF/DH5，由本所分子生物學(xué)實驗室構(gòu)建。試劑：酵母粉（Yeast extract，OXOID公司產(chǎn)品），蛋白胨（Tryptone，OXOID公司產(chǎn)品），瓊脂糖（Agar powder，日本進(jìn)口分裝公司，上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠），氯化鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、氯化銨均為分析純。1.2 方 法收稿日期：2004-06-02審 稿 人：申燁華，女，西北大學(xué)化學(xué)系副教授。內(nèi)培養(yǎng)過夜，OD600達(dá)1.0左右時即可進(jìn)行轉(zhuǎn)接。2 結(jié)果與討論2.

5、1 培養(yǎng)溫度對工程菌生長的影響微生物的生長和產(chǎn)物合成都是在各種酶催化下進(jìn)行的，溫度是保證酶活性的重要條件，因此在發(fā)酵過程中必須保證穩(wěn)定而合適的溫度環(huán)境。本實驗中選擇培養(yǎng)溫度27、30、32、35C進(jìn)行考察，實驗結(jié)果見圖1。 27, 30, × 32, 35圖1 培養(yǎng)溫度對重組大腸桿菌生長情況的影響Fig.1 Effect of culture temperature on the the growth of bacteria從圖1可看出，在27、30和32C培養(yǎng)時菌體密度均能達(dá)到5.00，但在32C時為最高。其原因是在較低溫度(如27C)進(jìn)行培養(yǎng)時細(xì)菌的生長代謝緩慢，菌體不能得到充分

6、的增殖，而在較高溫度(如35C)進(jìn)行培養(yǎng)時，雖然生長迅速，但代謝加快，生產(chǎn)期提前，對葡萄糖的利用過多，排謝出大量的代謝副產(chǎn)物（如乙酸等），抑制了菌體的生長，因而菌體密度較低7。所以，以下實驗均控制培養(yǎng)溫度在3032C。2.2 誘導(dǎo)時機(jī)對工程菌生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響基因工程菌的兩階段培養(yǎng)法是為了在擴(kuò)大菌體密度的同時，盡可能提高工程菌的表達(dá)水平，因此誘導(dǎo)時機(jī)是至關(guān)重要的因素，在研究溫控誘導(dǎo)策略時應(yīng)先確定最佳的誘導(dǎo)時機(jī)。表1 誘導(dǎo)時機(jī)對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響Tab.1 Effects of induction time on the growth of bacteria an

7、d expression of rhGM-CSF誘導(dǎo)時OD 6000.35 0.52 0.81 1.10 2.05由表1可見：在菌體的對數(shù)生長前期（OD 600=0.52、0.81）進(jìn)行誘導(dǎo)可獲得較高的表達(dá)量，在OD 600=0.35時誘導(dǎo)，由于菌體沒有充分增殖就擔(dān)負(fù)起表達(dá)外源基因產(chǎn)物和分裂后代的雙重任務(wù)，勢必難以獲得較高的菌體產(chǎn)量，比OD 600大約0.5時誘導(dǎo)的產(chǎn)量低；當(dāng)在對數(shù)生長中后期（OD 600=1.10、2.05）進(jìn)行誘導(dǎo)時，此時菌體雖充分增殖，但由于生存環(huán)境已經(jīng)惡化，pH下降，部分營養(yǎng)物質(zhì)減少甚至缺乏，使得工程菌的活力衰弱，不能給基因表達(dá)提供大量活力旺盛的細(xì)胞。因此，最好選擇在O

8、D 600為0.50.8之間升溫誘導(dǎo)。菌體密度OD 6003.652 5.191 5.245 4.783 4.232rhGM-CSF 表達(dá)量/%16.4 20.8 20.4 13.2 10.12.3 誘導(dǎo)表達(dá)時間對工程菌生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響采用兩階段培養(yǎng)法，在菌體生長到OD 600 0.5時升溫42誘導(dǎo)，考察表達(dá)時間對菌體生長和表達(dá)的影響，試驗結(jié)果見圖2。OD 600， rhGM-CSF表達(dá)量圖2 誘導(dǎo)表達(dá)時間對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響Fig.2 Effects of expression time on the growth of bacteria and expre

9、ssion of rhGM-CSF由圖2可看出，誘導(dǎo)45 h之后，菌體密度與表達(dá)量均達(dá)最大值。這可能是因為：誘導(dǎo)后第23 h，細(xì)菌培養(yǎng)物仍處于對數(shù)生長期，菌液密度較小，細(xì)菌培養(yǎng)物還在不斷繁殖，故此階段菌體密度和表達(dá)量都處于上升期；誘導(dǎo)45 h后，細(xì)菌進(jìn)入對數(shù)生長后期，培養(yǎng)液中細(xì)菌濃度趨于穩(wěn)定，表達(dá)也達(dá)最高；繼續(xù)誘導(dǎo)，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分不足，生存環(huán)境已經(jīng)惡化，菌體密度有所下降，表達(dá)量下降幅度較大。2.4 pH值對工程菌生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響培養(yǎng)基的pH值影響培養(yǎng)基中某些物質(zhì)和中間代謝產(chǎn)物的解離，從而影響微生物對營養(yǎng)成分的吸收和代謝。因此，各種微生物都有最適生長的pH值范圍，超出這個范圍，菌

10、體的生長就會受到影響甚至停止。在工程菌的搖瓶發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的初始pH值是一個重要參數(shù)，它對于細(xì)胞的正常生長和外源基因的高效表達(dá)都有影響8。本實驗中采用初始pH值分別為6.67.6的培養(yǎng)基，考察對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響，實驗結(jié)果見圖3。OD600， rhGM-CSF表達(dá)量圖3 培養(yǎng)基初始pH值對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響Fig.3 Effects of initial pH of culture media on the growth of bacteria and expression of rhGM-CSF2.5 接種量對工程菌生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響接種

11、量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。接入適量的種子，由于種子液中含有大量的體外水解酶類，有利于對基質(zhì)的利用，可以縮短生長的延遲期，并且使生產(chǎn)菌迅速占據(jù)了整個培養(yǎng)環(huán)境，可減少雜菌生長的機(jī)會。但是，如果接種量過多，往往使菌體生長過快，一方面會使培養(yǎng)液粘度增加，造成溶解氧不足，影響產(chǎn)物的合成，另一方面會加劇工程菌質(zhì)粒的丟失，使菌體表達(dá)外源蛋白的能力下降10。同樣，如果接種量過小，就會使發(fā)酵周期延長，不利于外源基因表達(dá)。本實驗中采用不同的比例接種，考察對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響，實驗結(jié)果見表2。表2 接種量對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響Tab.2 Effects of inoculu

12、m volumes on the growth of bacteria and expression of rhGM-CSF接種量/%1234從表2可見，無論從發(fā)酵菌體量還是從rhGM-CSF表達(dá)量上看，當(dāng)接種量為3時兩者均為最高，因此采用適當(dāng)?shù)慕臃N量有利于重組菌的生長和外源基因的表達(dá)，以后實驗中采用3的接種量。 OD600 3.55 4.27 5.34 5.12 4.87 表達(dá)量/% 15.3 17.9 21.6 19.3 16.92.6 搖床轉(zhuǎn)速對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響不同搖床轉(zhuǎn)速對工程菌生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響如表3所示。表3 搖床轉(zhuǎn)速對菌體生長和rhGM-CSF表

13、達(dá)的影響Tab.3 Effects of rotational speed on the growth of bacteria and expression of rhGM-CSF轉(zhuǎn)速/r·min-11401601802002202.7 種子菌齡對工程菌生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響種子液質(zhì)量的優(yōu)劣對發(fā)酵生產(chǎn)起著關(guān)鍵的作用，若將過于年輕的種子接入搖瓶中，往往會出現(xiàn)前期生長緩慢、整個發(fā)酵過程周期延長、產(chǎn)物形成的時間推遲等現(xiàn)象，甚至?xí)蚓w量過少而在發(fā)酵中結(jié)球，造成異常發(fā)酵。然而，菌齡過老，又會引起菌種生產(chǎn)能力的下降。因此，我們在實驗中將不同菌齡的種子液按3%的接種量接于M9培養(yǎng)基中，

14、培養(yǎng)OD600至 0.5左右，升溫至42誘導(dǎo)表達(dá)4 h，實驗結(jié)果見表4。 5表4 種子菌齡對菌體生長和rhGM-CSF表達(dá)的影響Tab.4 Effects of inoculum age on the growth of bacteria and expression of rhGM-CSF種子菌齡OD6000.5 1.0 1.5 2.0終止OD600 4.689 5.132 4.725 4.489rhGM-CSF表達(dá)量/%16.1 23.8 20.4 18.5由表4可見，種子液OD600在0.52.0時，隨種子液濃度增高，發(fā)酵液的終止OD600先升后降，而rhGM-CSF的表達(dá)量亦有一最佳值

15、。綜合考慮細(xì)胞密度和rhGM-CSF的表達(dá)量，選擇種子菌齡的OD600為1.0左右時較為合適。3 結(jié) 論通過對工程菌pDH/rhGM-CSF/DH5搖瓶發(fā)酵工藝條件的研究，確定出搖瓶發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度32；初始pH值7.27.4；搖床轉(zhuǎn)速200 r/min；種子菌齡在OD600為1.0左右時進(jìn)行接種；培養(yǎng)至OD600 0.50.8，升溫至42誘導(dǎo)表達(dá)4 h。用選定的優(yōu)化條件，發(fā)酵3批，結(jié)果見表5，電泳結(jié)果見圖4，rhGM-CSF的表達(dá)量平均24.3%，平均OD600可達(dá)5.35。由此可見，用我們構(gòu)建的工程菌發(fā)酵的穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，可為rhGM-CSF的大規(guī)模生產(chǎn)提供可靠的放大依據(jù)。

16、表5 優(yōu)化條件下的實驗結(jié)果Tab.5 The experimental results under optimal conditions 實驗批次1 2 3 平均OD600 5.445 5.238 5.369 5.350±0.112rhGM-CSF表達(dá)量/%24.2 24.7 23.9 24.3±0.4rhGM-CSF圖4 搖瓶優(yōu)化條件下SDS-PAGE圖Fig.4 The SDS-PAGE under optimal conditions in shaking flask參考文獻(xiàn)：1 METALF D. The granulocyte-macrophage colony

17、stimulating factorsJ. Science，1985，229：16-22.2 WONG G G，WITEK J S. Human GM-CSF：molecular cloning of the complementory DNA and purification of the natural recombinant proteinsJ. Science，1985，228：810-815.3 張智清，張 穎，路秀華，等. 人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子cDNA5'端的修飾提高其在大腸桿菌的表達(dá)J. 病毒學(xué)報，1993，9(2)：136-143.4 王嘉璽，鄒民吉，黃碧蓮，

18、等. 人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)J. 生物工程學(xué)報，1995，11(1)：33-38.5 姚 軍，甘人寶，張 倩，等. 人GM-CSF cDNA的克隆和在大腸桿菌中的表達(dá)J. 生物化學(xué)與生物物理學(xué)報，1996，28(3)：265-271.6 段淑敏，李福勝，楊新科，等. 大腸桿菌表達(dá)的rhGM-CSF發(fā)酵純化工藝研究J. 中國生物制品學(xué)雜志，1996，9(3)：124-128.7 劉社際，葛永紅，楊立明. 培養(yǎng)溫度對基因工程菌生長密度和rhG-CSF表達(dá)的影響J. 中國生物制品學(xué)雜志，1999，12(1)：29-31.8 張嗣良，李凡超. 發(fā)酵過程中pH及溶解氧的測

19、量與控制M. 上海：華東化工學(xué)院出版社，1992.9 熊宗貴. 生物技術(shù)制藥.第1版M. 北京：高等教育出版社，1999.90.10 曾 浩，鄒全明. 重組大腸埃希菌發(fā)酵工藝的影響因素及策略J. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2003，15(1)：57-59.11 楊海波，蘇志國. 腫瘤壞死因子基因工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化J. 生物學(xué)雜志，1999，16(4)：17-19.（編 輯 張銀玲）A study on the fermentation technology of recombinant E.coliexpressing human granulocyte-macrophage colony stim

20、ulating factor(hGM-CSF) in shaking flaskMA Li，BAI Quan，WANG Li-li，SI Qin，GENG Xin-du(Institute of Modern Separation Science, Shaanxi Key Laboratory of Modern Separation Science, Northwest University, Xian 710069, China)Absract: Fermentation technology of recombination E.coli expressing human granulocyte-macrophage colony stimulating factor(hGM-CSF) with shaking flask was optimized for rhGM-CSF. The experimental results show that the optimum conditions are: temperature 32, initial pH 7.27.4, rotating speed 200 r/min, and inoculum age 1.0 (OD600). It is available for inducing cultivation wh