金黃色葡萄球菌δ溶血素分泌特點的初步研究

1、金黃色葡萄球菌溶血素分泌特點的初步研究(1)時間曲線呈現(xiàn)“S”型，可分為分泌量微量增加、快速增加、平緩增加三個時期。結論 溶血素的分泌反映了金黃色葡萄球菌密度感應系統(tǒng)（agr system）調控外毒素分泌的特點。  【關鍵詞】  溶血素金黃色葡萄球菌高效液相色譜法 【Abstract】  Objective  For the further study, we attempt to acquaint ourselves

2、0;with the secretion of hemolysin in staphylococcus aureus.Methods  The amount of hemolysin from different strains and growth phases is analyzed by high performance liquid chr

3、omatography(HPLC) and the curve of the amount of hemolysin  vs growth time was drawn.Results  It is observed that the secretion of hemolysin is various in different&

4、#160;S. aureus strains and different growth phases, the curve of hemolysin secretion is synchronous with that of bacterial growth and can be divided into three phases.Conclusi

5、on  The secretion of hemolysin well reflects the regulation of access gene regulation (agr) system in S.aureus. 【Key words】  Deltahemolysin,staphylococcus aureus,HPLC 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus 

6、aureus，S.aureus）是人類主要的致病菌之一，可引起敗血癥、毒素休克綜合征（TSS）、心內膜炎、泌尿道感染、皮膚膿腫、食物中毒和傷口感染等，其致病性主要是因其能分泌20多種蛋白毒素。其中大部分蛋白毒素的合成主要受一個被稱為“數(shù)量閾值感應”系統(tǒng)（quorumsensing system，QS）的調控2。在金葡菌中，該系統(tǒng)由agr基因座（accessory gene regulator locus）編碼，稱agr system，近年來成為細菌毒素分泌調節(jié)研究3及新型抗菌藥物研發(fā)的熱點4，5。     

7、; 溶血素（hemolysin）是致病性金葡菌產(chǎn)生的四種重要的溶血素之一，其分泌的變化情況可間接反映agr 系統(tǒng)的活動情況6。      本研究的目的是首先建立在我們的實驗系統(tǒng)下用HPLC檢測溶血素的方法，其次觀察溶血素在不同菌株，不同生長時段的分泌情況，為更深層的研究打好基礎。 1  材料與方法 1.1  主要儀器及試劑  AKTA purifier 色譜儀（Amersham Pharmacia Biotech），紫外檢測器（UV900），Re

8、source PHE 1ml 色譜柱（Amersham Pharmacia Biotech），低溫離心機（Avanti J25, Beckman couter），乙腈（SigmaAldrich Laborchemikalien），tryptone（Oxoid），yeast extract（Oxoid），其它均為國產(chǎn)分析純。 1.2  菌株及生長條件  金黃色葡萄球菌ATCC 29213（耐青霉素的標準菌株），BAA4242（菌株洗脫曲線圖略）。

9、2.3  HPLC對同一菌株不同生長時段的溶血素的分泌量分析  取不同生長時段的菌液進行溶血素濃度的檢測，并繪制溶血素的分泌量時間曲線及菌液的OD值生長時間曲線。從圖1可以觀察到在菌的生長初期溶血素微量分泌，隨著菌密度的增大分泌量緩慢增加，當菌進入指數(shù)生長后期后溶血素分泌量迅速增加，進入菌生長的靜止期后，分泌量增加的幅度又趨變緩。整個分泌過程呈現(xiàn)出與菌的生長曲線圖形相近的變化趨勢，近似于“S”型，且變化出現(xiàn)的時間要晚于相應菌密度出現(xiàn)變化的時間。 圖1  金葡萄BAA42 溶血素分泌量時間與生長時間曲線（略） 3 &

10、#160;討論      金黃色葡萄球菌是一種最常見的引起院內嚴重感染的致病菌之一，可引起廣泛的感染。與金黃色葡萄球菌致病性密切相關的是調節(jié)金黃色葡萄球菌大部分外毒素的分泌的agr系統(tǒng)8，9，agr系統(tǒng)是一個密度閾值感應系統(tǒng)，在菌的生長過程中“感知”同類菌的密度，決定菌的生長、基因的表達及毒素的表達。該系統(tǒng)近年來成為降低細菌毒力及研制新型抗菌藥物的切入點。溶血素不同于金黃色葡萄球菌的其它蛋白毒素，其編碼基因hld位于agr系統(tǒng)毒素調節(jié)的效應分子 RNA的編碼區(qū)域內，與RNA同轉錄6，所以其分泌量可以間接反映agr系統(tǒng)的活動情況。在本研究中我們首

11、先優(yōu)化了HPLC法檢測溶血素的條件，對溶血素的進行最佳的分離和檢測，然后檢測了不同菌株及菌株不同生長時段的分泌情況，以期對溶血素的分泌情況有更加清楚的了解，為進一步實驗打好基礎。      溶血素的分泌與菌株的密度直接相關，在細菌生長初期分泌量少，當細菌進入指數(shù)生長后期時，分泌量明顯增加，至細菌生長進入靜止期以后，其分泌量的增加趨勢漸趨平緩，溶血素的分泌曲線可分為分泌量微量增加段、快速增加段及緩慢增加段，與細菌的生長曲線的形狀很相似，但時程上與后者約有1 h的延后。金黃色葡萄球菌毒素分泌所呈現(xiàn)的這一趨勢與其密度閾值感應系統(tǒng)（主要為agr系統(tǒng)）的

12、調節(jié)密不可分10。細菌通過感應生長介質中自身釋放的信號分子，又稱自身誘導分子（autoinducer，AI），來判斷同類菌的數(shù)量，調節(jié)基因的表達，而AI分子濃度與細菌的密度密切相關。當AI分子濃度達到閾值時，就會激活agr基因座的兩個效應分子RNA和RNA的轉錄，前者上調與AI分子合成分泌有關的基因，后者本身編碼溶血素，并且上調諸如溶血素、毒素休克綜合征毒素（TSST1）、腸毒素B等多種重要毒素基因的表達2，使整個菌群快速一致地產(chǎn)生大量毒力因子；在菌生長后期，由于營養(yǎng)物質的逐漸耗竭，有害代謝產(chǎn)物的積累，細菌的繁殖越來越慢，生理代謝活動也趨于停滯。以上整個調節(jié)過程對于細菌的生存和繁殖具有重要意義

13、：病原菌在密度很低時僅產(chǎn)生微量的毒力因子，可逃避宿主的免疫防御系統(tǒng)的識別，當細菌密度達到一定數(shù)量后，就會大量產(chǎn)生毒力因子，對宿主產(chǎn)生較大的影響；當密度過高時又會降低代謝以延長生命。      不同的菌株溶血素分泌的量和時程可以有很大的差別。通過檢測我們對實驗室已有的菌株的溶血素分泌情況有了大致的掌握，我們認為分泌能力高的菌株及分泌量大的指數(shù)生長后期和靜止期前期可分別作為待檢菌株和時間段，可以更加靈敏的反映加入干預措施后的變化，為下一步檢測藥物對agr系統(tǒng)的作用打好基礎。 【參考文獻】   1Lowy FD. Sta

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18、n and nucleotide sequence of the deltalysin gene, hld, adjacent to the accessory gene regulation（agr）of Staphylococcus aureusJ. Mol Gen Genet，1989，219:480485. 7Otto M, Gotz F.Analysis of quorum sensing activity in staphylococci by RPHPLC of staphylococcal deltatoxinJ. B