通脈醒腦滴丸對線栓法致腦缺血再灌注大鼠細胞凋亡線粒體信號轉導通路的影響

1、通脈醒腦滴丸對線栓法致腦缺血再灌注大鼠細胞凋亡線粒體信號轉導通路的影響                  作者：陳小睿，唐光曦，孟憲麗，黃雷雷，李佳川 【摘要】  目的 探討中藥復方制劑通脈醒腦滴丸防治腦缺血卒中可能的機理。 方法選用大鼠線栓阻斷大腦中動脈法復制腦缺血再灌注模型，運用免疫組化方法，測定腦組織bcl-2、Bax、Cyt-C和Caspase-3的表達，考察藥物對Caspase-3細胞凋亡通路的作用。結果通

2、脈醒腦滴丸下調神經細胞的促凋亡基因Bax、Caspase-3和CytC表達。結論研究初步證實通脈醒腦滴丸對腦缺血損傷的保護作用，可能與負調Caspase-3介導的細胞凋亡通路有關。 【關鍵詞】  通脈醒腦滴丸; 腦缺血; 再灌注 腦缺血卒中作為臨床常見的危重急癥，一直備受關注。目前認為對腦缺血的治療核心在于對神經元損傷的保護以及溶栓再通。是否能在腦缺血卒中發(fā)生后，盡可能延緩細胞凋亡組織壞死的進程，減輕神經元的損傷，是考察藥物對腦缺血保護作用的要點。 本實驗選用大鼠線栓法致局灶性腦缺血再灌注模型，采用免疫組織化學方法檢測腦組織神經細胞bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase-3的

3、表達，探求藥物是否可通過影響bcl-2或Bax的表達，影響Cyt-C在線粒體膜的聚集，進一步影響凋亡因子Caspase-3的表達，發(fā)揮其對抗缺血腦組織損傷和神經細胞凋亡的作用。 1 材料 1.1 藥物受試藥物：通脈醒腦滴丸，成都潤華堂藥業(yè)有限公司產品，批號：070530。規(guī)格：10 mg/粒。用法用量：口服，88粒/d，分4次服用。主治缺血性中風引起的半身不遂、口眼歪斜、言語不利、偏身麻木等。陽性對照藥物：尼莫地平片，山西亞寶藥業(yè)集團股份有限公司產品，批號：070109。規(guī)格：20 mg/片。用法用量：用于治療缺血性腦血管病，口服，30120mg/d。 1.2 試劑Rabbit Anti-Ca

4、spase-3，北京博奧生物技術有限公司產品;Cytochrome C(A-8)SC-13156，北京中杉金橋生物技術有限公司產品;Bax(P-19)SC-526，北京中杉金橋生物技術有限公司產品;bcl-2 GM88702，基因有限公司產品;ChemMate Envision HRP鼠/兔 GK500705，基因有限公司產品;其它實驗室常備試劑均為國產分析純。 1.3 儀器Leica rm 2135石蠟切片機，德國;Olympus-BX40型光學顯微鏡，日本Olympus公司產品;MIAS2000型計算機圖像工作系統(tǒng)，電子科大金盤多媒體科技有限公司產品;LD2-5醫(yī)用離心機，北京醫(yī)用離心機廠

5、產品;WH-2型微量旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠產品;DHW-600型不銹鋼電熱恒溫水箱，北京國華醫(yī)療器械廠產品;202-2型干燥箱，上海市實驗儀器總廠產品。其它實驗室常備器皿、耗材均為國產優(yōu)質品。    1.4 動物 SD大鼠，SPF級，質量(300±20)g，雌雄各半，由四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，合格證號：SCXK(川)2004-15。 2 方法 2.1 分組及給藥選取健康SD大鼠18只，雌雄各半，隨機將大鼠分為模型組、給藥組、假手術組3組，每組6只。其中給藥組給予通脈醒腦滴丸73.85 mg/kg;模型組和假手術組給予等體積蒸

6、餾水。灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥7 d。于第7天給藥1 h后，假手術組大鼠僅在麻醉狀態(tài)下分離右側頸總動脈，不予阻斷血流。模型組和給藥組參照下述方法，復制線栓法致大鼠腦缺血再灌注模型。 參照文獻方法13，第7天給藥1 h后，腹腔注射10%水合氯醛3.5 ml/kg(350 mg/kg)將大鼠麻醉，分離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，在距CCA分叉部4 mm處剪一小口，將拴線插入到ICA，實現對大腦中動脈(MCA)的阻斷。固定線栓。逐層縫合切口并消毒。MCA阻斷2 h后，拔出線栓，進行再灌注。假手術組大鼠僅在麻醉狀態(tài)下分離右側頸總動脈，不予插入線栓阻斷血流。 再灌

7、注24 h后，各組大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，剪開胸壁，暴露心臟，將灌流裝置的針頭刺入左心室，止血鉗固定，剪開右心耳，生理鹽水250 ml快速灌流沖洗至肺葉和肝臟變白，換用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液250 ml灌注固定，30 min后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中低溫避光固定24 h。心臟灌流前1h給藥1次。 常規(guī)制備石蠟切片，HE染色項下，采用DAKO EnVision顯色系統(tǒng)，光鏡100×視野下尋找海馬結構，400×視野下，運用電子科技大學金盤科技有限公司MIAS2000型計算機圖像工作系統(tǒng)，對染色結果進行檢測，每張片

8、選取不重疊的10個視野，每個視野選20個細胞，統(tǒng)計陽性表達的細胞數和陽性面積百分比。 2.2 統(tǒng)計方法運用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。 3 結果 3.1 對線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織神經細胞Bax表達的影響結果見表1。表1 對線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織神經細胞Bax表達的影響(±s) 在高倍鏡下，免疫組織化學染色結果顯示：大鼠腦組織神經細胞Bax蛋白主要在胞漿出現陽性表達。正常大鼠神經細胞Bax有一定的陽性表達，而腦缺血再灌注大鼠的神經細胞表達則出現幾乎滿視野表達，染色呈棕黃或黃褐色。從表1可見，模型組大鼠腦組織神經細胞的Bax表達較假手術組有明顯的升高(P<

9、;0.01)。通脈醒腦滴丸組較之模型組，Bax陽性細胞表達和陽性面積比明顯降低(P<0.01)，提示通脈醒腦滴丸具有減少大鼠腦缺血再灌注損傷后神經細胞Bax表達的作用。    3.2 對線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織細胞色素C(Cyt-c)表達的影響表2 對線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織神經細胞Cyt-C表達的影響(±s)在高倍鏡下，免疫組織化學染色結果顯示，大鼠腦組織神經細胞Cyt-C蛋白主要在胞漿出現陽性表達。正常大鼠神經細胞Cyt-C的有一定陽性表達，而腦缺血再灌注大鼠的神經細胞表達則相對較高，染色呈棕黃或黃褐色。從表2可見，模型組

10、大鼠腦組織神經細胞的Cyt-C表達較假手術組有明顯的升高(P<0.01)，給藥組較之模型組，Cyt-C陽性細胞表達個數和陽性面積比明顯降低(P<0.01)，提示通脈醒腦滴丸具有減少大鼠腦缺血再灌注損傷神經細胞Cyt-C表達的作用。 3.3 對線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織神經細胞Caspase-3表達的影響結果見表3表3 對線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織神經細胞Caspase-3表達的影響(±s) 高倍鏡下，免疫組織化學染色結果顯示，大鼠腦組織神經細胞Caspase-3蛋白在胞漿和胞核均出現陽性表達。正常大鼠神經細胞Caspase-3有一定陽性表達，而模型組大鼠幾乎出現滿

11、視野的陽性表達，染色呈棕黃或黃褐色。從表3可見，模型組大鼠腦組織神經細胞的Caspase-3表達較假手術組有明顯的升高(P<0.01)。通脈醒腦滴丸組較之模型組，Caspase-3陽性細胞表達和陽性面積比有所降低(P<0.05)，提示通脈醒腦滴丸具有減少大鼠腦缺血再灌注損傷神經細胞Caspase-3表達的作用。 3.4 對線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織神經細胞bcl-2表達的影響在高倍鏡下，免疫組織化學染色結果顯示，正常組和給藥組大鼠神經細胞bcl-2未見陽性表達，而腦缺血再灌注大鼠的神經細胞僅出現極少量表達，平均每100個細胞約有1個陽性細胞表達，染色呈黃褐色，分布在神經膠質細胞

12、胞漿和胞膜。 4 討論 由上實驗結果可見，通脈醒腦滴丸能通過減少腦缺血再灌注大鼠腦組織Bax的表達，引發(fā)線粒體內釋放到胞漿的Cyt-C相對于模型組明顯減少，進一步導致Caspase-3表達減少，發(fā)揮明顯的抗凋亡作用。但我們的實驗中，通脈醒腦滴丸組和假手術組未見bcl-2的陽性表達。 實驗證明，通脈醒腦滴丸可通過減少腦組織Bax的陽性表達，負調Caspase-3介導的細胞凋亡的線粒體通路，保護缺血損傷的腦組織。 由體內外因素觸發(fā)細胞內預存的死亡程序而導致的細胞死亡過程稱為細胞凋亡(apoptosis)，又稱程序性細胞死亡(programmed cell death，PCD)。細胞內外的凋亡因素通

13、過各種受體作用于細胞后，產生一系列復雜的生化反應，形成與凋亡相關的第二信使，繼而通過胞內的信號轉導途徑激活后續(xù)凋亡程序。調控凋亡的基因接受由信號轉導途徑傳來的死亡信號后，啟動并合成執(zhí)行凋亡所需的各種酶類和相關物質。繼而由核酸內切酶和Caspase執(zhí)行死亡，前者破壞生命活動必須的所有指令，后者導致細胞結構的全面解體。    腦缺血損傷所致的細胞凋亡過程中，許多相關的細胞因子以及其它因素皆參與其中。如p53基因、早期即刻反應基因等，但目前認為，神經元凋亡最重要的調節(jié)者是Caspase(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)家族和bcl-2家族4。 大量研究表明Caspas

14、e家族在細胞凋亡機制中處于中心位置，而其中Caspase-3處于Caspase蛋白酶系的核心地位，通過切割多種不同的底物，導致蛋白酶系級聯切割反應放大，最終誘導細胞走向死亡。 Caspase的激活途徑按照啟動酶活性信號的起源分成線粒體通路、死亡受體通路和內質網通路。而由細胞色素C(Cyt-C)的釋放介導的線粒體通路被廣泛關注。研究證明，細胞色素C的釋放與bcl-2家族成員密切相關。 bcl-2家族即B細胞淋巴瘤/白血病-2基因家族，被認為是與PCD密切相關的一組通道蛋白，主要位于線粒體、內質網和細胞核外膜。bcl-2家族包括抑制PCD發(fā)生的bcl-2、bcl-X1等以及促進細胞凋亡的Bax和b

15、cl-Xs等。 bcl-2是細胞凋亡的重要抑制基因，定位于線粒體上，其功能是維持線粒體膜的完整性，控制著線粒體的深透轉換(permeability transition)和離子、蛋白的外流，阻止線粒體膜整合蛋白的釋放，尤其是細胞色素C的釋放，而阻斷Caspase的激活，最終表現出凋亡抑制活性5。在腦缺血再灌注損傷中，bcl-2蛋白維持促凋亡成員在細胞內的定位分布，保護細胞不進入凋亡程序，同時控制細胞色素C的釋放 6。 與bcl-2在凋亡進程中密切相關的Bax基因，是bcl-2家族中第一個被確認有細胞凋亡促進作用的成員。Bax主要位于胞質中，在凋亡信號誘導后很快遷移到線粒體，與線粒體膜結合，形成

16、滲透性膜轉移孔復合物，形成線粒體膜通道，將細胞凋亡的啟動因子細胞色素C釋放到胞質中，發(fā)動下一級的促凋亡反應。 研究發(fā)現，促凋亡蛋白Bax通過促進電壓依賴性陰離子通道VDAC開放而誘導Cyt-c從線粒體釋放;抗凋亡蛋白bcl-2則通過與VDAC直接結合而關閉VDAC來阻止Cyt-C釋放7。 Cyt-C是生物氧化的一個非常重要的電子傳遞體。正常情況下細胞色素C穩(wěn)定性地結合于線粒體內膜，不能通過外膜。在受到凋亡信號的刺激后，細胞色素c通過線粒體膜的滲透性轉移孔道釋放出來，與凋亡促進因子-l(Apaf-1)和Caspase-9結合形成復合體，在ATP參與下，使Caspase蛋白酶家族發(fā)生酶解級聯激活，

17、主要通過Caspase-3的激活造成基因組DNA裂解，同時使DNA修復相關酶失活，造成DNA修復能力降低，以凋亡執(zhí)行過程8。細胞色素C的胞外釋放是腦缺血再灌注后線粒體凋亡通路中的關鍵的環(huán)節(jié)，應用激光共聚焦，放射免疫測定等實驗方法，都證實了線粒體依賴性的凋亡通路中細胞色素C胞外釋放這一環(huán)節(jié)9。    基于上述，本實驗采用免疫組化的方法，檢測了線栓法致大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后，誘導細胞凋亡的線粒體信號轉導途徑的重要通路因子bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase-3的水平，以探究藥物通脈醒腦滴丸是否能通過作用于該通路，減少凋亡相關因子的表達，發(fā)揮其

18、腦保護作用。 結果顯示通脈醒腦滴丸可明顯減少Caspase-3、Cyt-C陽性細胞個數，且著色較淺。表明通脈醒腦滴丸可能通過減少Cyt-C釋放和下調Caspase-3蛋白的表達而減少凋亡的產生，在線粒體途徑所介導的細胞凋亡過程中發(fā)揮了腦保護作用。同時，與模型組比較，通脈醒腦滴丸組大鼠海馬區(qū)Bax表達明顯減少。表明通脈醒腦滴丸能通過下調凋亡促進因子Bax的表達，抑制Cyt-C釋放，對抗缺血再灌注后腦神經細胞的凋亡，發(fā)揮腦缺血防治作用。 有研究發(fā)現，在生長發(fā)育過程中，神經系統(tǒng)的bcl-2蛋白呈高表達，以后隨年齡的增加bcl-2免疫反應迅速下降，成年后bcl-2蛋白的免疫反應通常不能檢出，故假手術組

19、未見bcl-2陽性表達。模型組僅出現少量bcl-2陽性表達，通脈醒腦滴丸組亦未見bcl-2陽性表達，提示藥物對抗細胞凋亡的作用機制，可能主要與減少Bax基因的表達，抑制Cyt-C從線粒體的釋放相關。 綜上所述，通脈醒腦滴丸可通過減少缺血腦組織海馬Bax、Cyt-C和Caspase-3的陽性表達，抑制Caspase-3介導的細胞凋亡，發(fā)揮對抗腦缺血的作用，為中藥復方制劑防治腦缺血卒中的機理提供了新的佐證。 【參考文獻】  1 竇萬臣，王任直，張 波，等.大鼠局灶性腦缺血模型制作方法的改進J.中國腦血管病雜志，2004，1(2)：81.2 陳佳俊，石巖殊，韓雪梅.線栓法大鼠局灶性腦缺血模型(PMCAO)的實驗研究J.吉林醫(yī)學，2004，25(10)：16.3 劉運泉，戴 穎.線栓法大鼠局灶性腦缺血模型的改進J.中國臨床解剖學雜志，2005，23(2)：222.4 Plesnila N.Role of mit