熒光分析法在生物領(lǐng)域的應(yīng)用于發(fā)展

1、熒光分析法在生物領(lǐng)域的應(yīng)用于發(fā)展摘要：本文對熒光分析法在檢測細(xì)胞活性，測定生物樣品，推斷生物成蟲日齡，研究生物群落動(dòng)態(tài)的應(yīng)用與進(jìn)展進(jìn)行了綜述與分析。并就其包含的不同方法進(jìn)行一一介紹，展望了熒光分析法技術(shù)在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞:熒光分析法 生物領(lǐng)域 應(yīng)用發(fā)展引言：利用某些物質(zhì)被紫外光照射后所發(fā)生的能反映出該物質(zhì)特性的熒光，可以進(jìn)行定性或定量分析的方法。當(dāng)照射停止后，如化合物的發(fā)射在10-9秒鐘內(nèi)停止，則稱熒光超過此限度即稱為磷光。特點(diǎn)：靈敏度更高 10-10-10-12g/ml，應(yīng)用不如UV廣泛。SO2分 子受特定光照射后處于激發(fā)態(tài)的SO2分子返回基態(tài)時(shí)發(fā)出熒光, 其熒光強(qiáng)度與SO2呈線

2、性關(guān)系, 從而可測出氣體濃度。當(dāng)檢測儀器系統(tǒng)確定后，熒光總光強(qiáng)I與SO2濃度的之間的關(guān)系可表示為：I=KC 在穩(wěn)定的條件下，這些參數(shù)也隨之確定，k可視為常數(shù)。因此，式I=kC表示的紫外熒光光強(qiáng)I與樣氣的濃度C成線性關(guān)系。這是紫外熒光法進(jìn)行定量檢測的重要依據(jù)。 熒光色譜法相關(guān)內(nèi)容1. 熒光色譜法的近期發(fā)展?fàn)顩r（1）近10年來,由于微量分析的需要迅速增加,靈敏度高選擇性強(qiáng)的熒光分析法日益受到重視。有關(guān)文獻(xiàn)數(shù)量猛增,內(nèi)容也從一般儀器及分析方法介紹發(fā)展到高精度、高靈敏度、自動(dòng)化、多用途的新儀器新技術(shù)研究。熒光分析對象從以無機(jī)樣品為主發(fā)展到以有機(jī)及生化樣品為主,并從成分分析向化學(xué)結(jié)構(gòu)、化學(xué)形式、微觀分析

3、、空間分布等狀態(tài)分析發(fā)展,應(yīng)用遍及各個(gè)領(lǐng)域。熒光光譜圖冊也陸續(xù)出版,美國費(fèi)城Sadtler研究實(shí)驗(yàn)室自1974年起出版標(biāo)準(zhǔn)熒光光譜圖及各專用熒光光譜圖(如藥物)。熒光分析法的應(yīng)用范圍與發(fā)射光譜法、火焰光度法、質(zhì)譜法等相仿,成為一種重要的儀器分析方法。（2）熒光分析法在納米生物分析中的應(yīng)用巨大。納米熒光探針、納米生物傳感器等納米生物分析材料器件的特性及其在生物分析中的應(yīng)用。對發(fā)光量子點(diǎn)、復(fù)合型熒光納米粒子和具有光學(xué)活性的金屬納米粒子作為生物分子的標(biāo)記探針取得了成果。2.熒光分析法基本原理分子角度分子的激發(fā)態(tài)，單線激發(fā)態(tài)和三線激發(fā)態(tài)大多數(shù)分子含有偶數(shù)電子，在基態(tài)時(shí)，這些電子成對地存在于各個(gè)原子或分

4、子軌道中，成對自旋，方向相反，電子凈自旋等于零：S=+(-)=0，其多重性M=2S+1=1 (M為磁量子數(shù))，因此，分子是抗（反）磁性的，其能級(jí)不受外界磁場影響而分裂，稱“單線態(tài)”圖1單線基態(tài)（A）、單線激發(fā)態(tài)（B）和三線激發(fā)態(tài)（C）當(dāng)基態(tài)分子的一個(gè)成對電子吸收光輻射后，被激發(fā)躍遷到能量較高的軌道上，通常它的自旋方向不改變，即S=0，則激發(fā)態(tài)仍是單線態(tài)，即“單線(重)激發(fā)態(tài)”；如果電子在躍遷過程中，還伴隨著自旋方向的改變，這時(shí)便具有兩個(gè)自旋不配對的電子，電子凈自旋不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1其多重性：M=2S+1=3即分子在磁場中受到影響而產(chǎn)生能級(jí)分裂，這種受激態(tài)稱為“三線(重)

5、激發(fā)態(tài)”；“三線激發(fā)態(tài)”比“單線激發(fā)態(tài)”能量稍低。但由于電子自旋方向的改變在光譜學(xué)上一般是禁阻的，即躍遷幾率非常小，只相當(dāng)于單線態(tài)單線態(tài)過程的10-610-7。3.熒光分析法的注意事項(xiàng)（1） 熒光的減退熒光物質(zhì)經(jīng)紫外線長時(shí)間照射及空氣的氧化作用，會(huì)使熒光逐漸減退。（2）試劑的濃度有些試劑能吸收紫外線，有顏色的試劑還有吸收熒光的作用，因此分析時(shí)所加試劑的量不可太多。(3)pH的影響 大多數(shù)熒光反應(yīng)都受溶液酸堿度的影響，故熒光分析需在適合的酸堿度溶液中進(jìn)行。最適當(dāng)?shù)乃釅A度必須由實(shí)驗(yàn)來確定。所用酸的種類也影響熒光的強(qiáng)度，例如，奎寧在硫酸溶液中的熒光較在鹽酸中的要強(qiáng)些。4.熒光分析法生物領(lǐng)域具體內(nèi)容a

6、熒光分析法檢測細(xì)胞活性應(yīng)用二乙酸熒光素(FDA)-溴化乙錠(EB)雙染色同步熒光分光光度法測定細(xì)胞活性變化,靈敏度和特異性與普通熒光分光光度法相比較有所提高。方法FDA-EB對已知比例的死、活細(xì)胞雙染色,選擇入=40nm進(jìn)行同步熒光掃描,與普通熒光分光光度法測定值進(jìn)行比較。結(jié)果該方法與通常的熒光法相比,靈敏度有較大提高,并能確定溶液中死、活細(xì)胞比例關(guān)系。結(jié)論FDA-EB雙染色同步熒光分光光度法可用于細(xì)胞活性變化的定性定量分析。b熒光分析法測定生物樣品通過電化學(xué)氧化腎上腺素,使其生成羥基吲哚類熒光物質(zhì)(em=490nm),實(shí)現(xiàn)了藥物中腎上腺素含量的電化學(xué)氧化-熒光檢測。研究結(jié)果表明,熒光強(qiáng)度與腎

7、上腺素濃度分別在2.0010-71.0010-6mol/L和1.0010-64.0010-5mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,檢出限為6.7010-8mol/L。該方法用于藥物制劑中腎上腺素含量的測定,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.88%(n=7),加標(biāo)回收率為88.4%116.6%。c熒光分析法推斷生物成蟲日齡蝶啶熒光分析法用于緋顏裸金蠅Achoetandrus rufifacies成蟲日齡及進(jìn)一步用于死亡時(shí)間推斷的潛力。方法:將A.rufifacies成蟲于16、20、24、28和325種恒溫下飼養(yǎng),此后取樣1次/23 d。取各日齡雌、雄成蟲頭殼于Tris-HCl(pH 80)緩沖液中勻漿,離心,用

8、熒光分光光度計(jì)測定上清液的熒光強(qiáng)度。結(jié)果:在5種恒溫下,雌、雄成蟲頭殼蝶啶含量與日齡均呈顯著的線性關(guān)系(r2087,P087,P052,P001),其中雌成蟲日齡估計(jì)誤差平均為36 d,雄成蟲23 d。結(jié)論:蝶啶熒光分析法可有效用于A.rufifacies成蟲日齡的推斷。d熒光分析法研究生物群落動(dòng)態(tài)目前常用于分析色素濃度的分光光度法靈敏度較低，當(dāng)樣品中色素含量很低時(shí)，難以檢出。也有研究曾經(jīng)采用了同步熒光法測定了海洋浮游植物的葉綠素，但至今還未見用于湖泊底泥中色素分析的報(bào)道.Yuk。等人應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)法分析了Baikal湖湖泊沉積物中的色素L，該方法檢測限很低，靈敏度極高.但此法樣

9、品前處理過程較為復(fù)雜，且成本較高.而熒光分析法靈敏度較高，所需樣品量少，更為簡便、快速和經(jīng)濟(jì).雖然藍(lán)藻一般在夏季形成水華，但是認(rèn)識(shí)藻類在底泥中初春的動(dòng)態(tài)規(guī)律有助于了解水華形成的機(jī)理.本文以太湖梅梁灣地區(qū)的底泥為材料，利用熒光分析法測定藻藍(lán)素含量，并用同步熒光分析法同時(shí)測定湖泊底泥中的葉綠素a、葉綠素b含量，目的是利用不同色素的定量分析來表征底泥中不同類群藻類的比例，為探討不同季節(jié)底泥中水華藍(lán)藻存在狀態(tài)與春季藍(lán)藻復(fù)蘇以及隨后水華發(fā)生的時(shí)空關(guān)系提供技術(shù)支持。5.熒光分析法及其衍生的前景展望生物分析已成為現(xiàn)代分析化學(xué)發(fā)展的最重要的前沿領(lǐng)域之一。為了適應(yīng)這種形勢的要求，眾多分析化學(xué)工作者正在不斷努力開

10、發(fā)著新的方法和技術(shù)。納米尺度上的生物分析化學(xué)就是其中的一個(gè)重要代表。納米生物分析材料和器件及其在生物分析中的應(yīng)用是當(dāng)今國際分析科學(xué)領(lǐng)域的研究前沿及發(fā)展方向之一，是各國關(guān)注重視的研究熱點(diǎn)。在生物醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)中應(yīng)用最多的是分子光譜分析方法。其中由于熒光光譜的靈敏度高選擇性好，因此對分子熒光方面的研究更是十分活躍。納米生物分析和熒光法的結(jié)合最為緊密。本文對熒光分析法在納米生物分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。熒光探針作為研究生物大分子（如：核酸、蛋白質(zhì)）的有力工具，在 20 世紀(jì) 90 年代取得了長足的進(jìn)展，新的靶擴(kuò)增技術(shù)（PCR）已日臻完善，發(fā)光標(biāo)記探針也已經(jīng)與放射性同位素標(biāo)記具有同等重要的地位，

11、而且已應(yīng)用于 DNA 雜交研究、疾病診斷和食品微生物檢測等方面。熒光探針除應(yīng)用于核酸和蛋白質(zhì)的定量分析外，在核酸染色，DNA 電泳，核酸分子雜交，定量 PCR 技術(shù)以及 DNA 測序上都有著廣泛的應(yīng)用前景。6.參考文獻(xiàn)【1】陳國珍，黃賢智，許金鉤，等熒光分析法M北京：科學(xué)出版社，1990：93-134【2】邊興艷. MTT比色法及其應(yīng)用J.國外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊,1998,19(2):8385【3】張先杰.臺(tái)盼藍(lán)染色與FDA/PI雙染色對檢測肝細(xì)胞活率的評價(jià)J.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2000,21(3):258【4】陳國珍等著.熒光分析法M.北京:科學(xué)出版社第二版,1990 .【5】B

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