腦微透析探針置入對(duì)透析樣品的影響

1、腦微透析探針置入對(duì)透析樣品的影響    【摘要】  目的 探討微透析探針置入的刺激對(duì)大鼠紋狀體內(nèi)谷氨酸水平的影響。 方法 通過(guò)初次和二次置入微透析探針至大鼠紋狀體并收集腦微透析液,結(jié)合高效液相色譜法檢測(cè)透析液谷氨酸水平。 結(jié)果 探針初次置入紋狀體谷氨酸水平立即升高約30倍,3 h后降至基礎(chǔ)值;二次置入時(shí)谷氨酸僅升高約15倍,1 h后即降至基礎(chǔ)值。 結(jié)論 微透析探針置入的刺激可引起大鼠紋狀體內(nèi)谷氨酸水平短暫增高,在腦微透析檢測(cè)谷氨酸樣品時(shí)應(yīng)注意探針置入的影響。 【關(guān)鍵詞】  腦; 微透析; 谷氨酸; 高效液相色譜  

2、  ABSTRACT:  Objective  To investigate the influence of glutamate levels in rat striatum after intracerebral implantation of microdialysis probe.  Methods  Microdialysis probe was inserted into rat striatum by one-time or two-time insertions.  Dialysate was collected an

3、d detected for glutamate levels with high performance liquid chromatograph(HPLC).  Results  The insertion of microdialysis probe into striatum at first time results in a transient raise in glutamate(about 30-fold above baseline), and declined to baseline within 3 hours.  While glutama

4、te levels were increased only 15-fold above baseline when microdialysis probe reinsert into striatum, and dropped to baseline within 1 hour.  Conclusion  The data suggest that the implant trauma may cause transient glutamate perturbations in rat striatum.  Thus, the influence of probe

5、 implantation for detecting glutamate samples by intracerebral microdialysis need to be considered.    KEY WORDS:  brain; microdialysis; glutamic acid; chromatography,high performance liquid    腦微透析技術(shù)是一種腦內(nèi)生物化學(xué)物質(zhì)活體取樣方法,其原理是將具有半透膜作用的探針置于生物體特定腦區(qū),以恒定速度通過(guò)探針灌注與組織液成分相近的等滲

6、灌流液,當(dāng)灌流液流經(jīng)探針前端透析膜時(shí),位于膜外側(cè)的組織內(nèi)較小分子質(zhì)量生物活性物質(zhì)將順濃度梯度從膜外擴(kuò)散入膜內(nèi),并隨灌流液被引流出探針外。以一定的時(shí)間間隔收集微透析液,并采用高靈敏度化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)連續(xù)檢測(cè)透析液中待測(cè)生物活性物質(zhì)濃度,可監(jiān)測(cè)活體動(dòng)物或人體特定腦區(qū)細(xì)胞外生物活性物質(zhì)濃度隨時(shí)間改變的動(dòng)態(tài)變化。    雖然腦微透析術(shù)是一種微創(chuàng)技術(shù),但置入體積較單個(gè)細(xì)胞及細(xì)胞間隙均相對(duì)大的探針至靶組織,必然會(huì)引起鄰近部位的生物化學(xué)、生理學(xué)及組織學(xué)改變,例如局部血流量增加、組織水腫,細(xì)胞死亡、神經(jīng)膠質(zhì)增生、出血等1-2,這些變化可在一定程度及一定時(shí)間引起鄰近神經(jīng)組織遞質(zhì)釋放量的

7、異常增加或減少,從而使透析液中待測(cè)物質(zhì)濃度不能真實(shí)反映腦內(nèi)的正常情況。因此合理使用微透析探針以減少探針置入刺激對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響,并選擇盡可能接近腦內(nèi)真實(shí)的透析液結(jié)果,是該技術(shù)應(yīng)用中亟待解決的問(wèn)題之一。筆者以檢測(cè)大鼠紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸為例,通過(guò)對(duì)同一只大鼠紋狀體內(nèi)初次/二次置入微透析探針,并即時(shí)收集腦微透析液,結(jié)合在線(xiàn)高效液相色譜分析,檢測(cè)透析液中谷氨酸水平,探討不同探針置入條件對(duì)微透析樣品中待測(cè)物質(zhì)濃度及樣品收集時(shí)間的影響,為微透析探針的合理使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。    1  材料與方法    1.1  材料&

8、#160;   1.2  方法計(jì)算各探針的相對(duì)回收率:    RAm/As×100%    1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  新探針回收率及谷氨酸檢測(cè)值占基礎(chǔ)值的百分比視為記量資料,以x±s表示,全部數(shù)據(jù)以SPSS 13.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析。    2  結(jié)  果    2.1  新探針體外相對(duì)回收率  各新探針體外相對(duì)回收率為(22.36±4.48)。 &#

9、160;  2.2  HPLC檢測(cè)谷氨酸色譜圖  以探針置入大鼠紋狀體24 h后安靜時(shí)為基礎(chǔ)狀態(tài)，測(cè)得谷氨酸基礎(chǔ)值約為3 mol/L(n10)(圖1)。    圖1  高效液相色譜檢測(cè)紋狀體透析液中谷氨酸基礎(chǔ)值    Fig 1  HPLC trace of a basal striatal dialysate sample showing the presence of glutamate   2.3  紋狀體內(nèi)谷氨酸隨探針置入時(shí)間的變化  探

10、針初次置入時(shí)谷氨酸立即較基礎(chǔ)值增高約30倍,經(jīng)3 h降至基礎(chǔ)水平;二次置入時(shí)增高約15倍,1 h后降至基礎(chǔ)水平(圖2)。    n=10.  以谷氨酸達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)為基礎(chǔ)值,谷氨酸變化以占基礎(chǔ)值的百分比表示.     圖2  初次/二次探針置入時(shí)大鼠紋狀體內(nèi)谷氨酸的變化    Fig 2  The variation of glutamate levels after primary and secondary probe implantation  

11、60; 3  討  論    3.1  腦微透析技術(shù)面臨的問(wèn)題  腦微透析術(shù)作為檢測(cè)細(xì)胞外間隙神經(jīng)遞質(zhì)濃度的方法,近年來(lái)發(fā)展十分迅速,但同時(shí)也伴隨著各種問(wèn)題。該技術(shù)應(yīng)用的前提是透析出的細(xì)胞外物質(zhì)濃度能較為準(zhǔn)確地反映腦內(nèi)細(xì)胞外間隙的物質(zhì)水平,但由于探針回收率變化等原因,實(shí)際透析液中待測(cè)化學(xué)物質(zhì)的濃度僅代表其在腦內(nèi)細(xì)胞外間隙部分的水平;而腦微透析術(shù)的優(yōu)點(diǎn)之一是可以長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)觀(guān)察腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)變化,但微透析探針的置入對(duì)腦組織有一定的刺激,反復(fù)插拔探針可多次刺激腦組織,持續(xù)留置探針(3 d)也易引起各種組織生化反應(yīng),例如探針置入部位周

12、圍可出現(xiàn)肥大星形膠質(zhì)細(xì)胞的浸潤(rùn)2,5,并且這些聚集在探針前端透析膜外的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生可產(chǎn)生非多肽類(lèi)分子的擴(kuò)散屏障,減弱周?chē)窠?jīng)元的化學(xué)反應(yīng)2;同時(shí)機(jī)體血腦屏障的通透性在探針置入后也可能增高3,6;灌流液中某些離子濃度改變亦可使腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)釋放量增加或減少,這些因素都可能影響透析結(jié)果對(duì)腦內(nèi)真實(shí)情況的解釋。Horn等人在權(quán)衡多方面因素后認(rèn)為,探針長(zhǎng)期留置腦內(nèi)可避免探針?lè)磸?fù)置入對(duì)腦組織的多重刺激,有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定7。Rey-nolds等建議采用在每天微透析結(jié)束時(shí)將探針拔出，次日重新插入的方法,以避免慢性腦微透析所產(chǎn)生星形膠質(zhì)細(xì)胞突起伸入探針透析膜的現(xiàn)象以及炎癥反應(yīng)8。目前一般建議在探針置入81

13、2 h后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)及樣品收集。    3.2  腦微透析技術(shù)改良之處  在實(shí)驗(yàn)前對(duì)所用探針進(jìn)行體外相對(duì)回收率測(cè)定,以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可比性。通過(guò)對(duì)探針初次置入與二次置入的比較,提示微透析探針置入刺激可引起大鼠紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸水平的短暫增高,且隨置入條件的不同引起遞質(zhì)水平增高的程度及恢復(fù)的時(shí)間也不同。因此,在以腦微透析技術(shù)檢測(cè)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)樣品時(shí)應(yīng)特別注意排除探針置入的影響,尤其是對(duì)于因檢測(cè)時(shí)間短、間隔期長(zhǎng)而采用探針間隔置入方法的慢性腦微透析實(shí)驗(yàn)時(shí),建議適時(shí)收集透析液:收集時(shí)間至少在探針初次置入后3 h,二次(或后續(xù))置入后1 h。另外需

14、特別指出的是,考慮到引導(dǎo)管內(nèi)芯與微透析探針之間有前端透析膜長(zhǎng)度的差別,建議采用廢棄的微透析探針作為兩次置入探針間期的過(guò)渡,以盡量降低探針替換過(guò)程中對(duì)腦組織的多次損傷。    要分析腦內(nèi)一種神經(jīng)遞質(zhì)的細(xì)胞外濃度,不僅受到神經(jīng)元突觸末梢釋放的影響,還受到酶降解、遞質(zhì)擴(kuò)散和再攝取等諸多方面的影響,是個(gè)極為復(fù)雜的生物化學(xué)過(guò)程,而在腦微透析過(guò)程中探針置入的刺激、樣品收集的時(shí)間、動(dòng)物的個(gè)體差異等也都會(huì)影響樣品的檢測(cè)結(jié)果。因此,要得到更加真實(shí)、確切的腦內(nèi)相關(guān)資料,首先應(yīng)建立穩(wěn)定的腦微透析方法,本研究結(jié)果可為腦微透析實(shí)驗(yàn)的相關(guān)研究提供參考。【參考文獻(xiàn)】  1 Bunga

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