鑭系離子時(shí)間分辨熒光檢測(cè)法在核酸分析技術(shù)中的應(yīng)用

1、鑭系離子時(shí)間分辨熒光檢測(cè)法在核酸分析技術(shù)中的應(yīng)用游冬青 陳 杞第二軍醫(yī)大學(xué)，上海， 200433) 摘要 本文綜述了鑭系離子時(shí)間分辨熒光技術(shù)在核酸分折領(lǐng)域中的應(yīng)用概況，介紹了DELFIA系統(tǒng)、FIAgen系統(tǒng)和EALL系統(tǒng)的使用特點(diǎn)，包括時(shí)間分辨熒光分析原理、鑭系離子標(biāo)記DNA探針和運(yùn)用時(shí)間分辨熒光技術(shù)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的技術(shù)和方法 鑭系離子時(shí)間分辨熒光(TRF)分析技術(shù)是一種新穎的非放射性標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)在核酸的定量定性分析中已得到廣泛的應(yīng)用。在檢測(cè)的特異性、靈敏度、測(cè)量速度以及標(biāo)記物的穩(wěn)定性方面都顯示出一定的優(yōu)越性。目前國(guó)內(nèi)外將時(shí)間分辨熒光法應(yīng)用于核酸分析領(lǐng)域中主要包括兩個(gè)方面，是應(yīng)用鑭系離子

2、標(biāo)記的DNA探針技術(shù)進(jìn)行雜交分析，二是將鑭系離子標(biāo)記技術(shù)引入PCR中，使PCR產(chǎn)物鑒定簡(jiǎn)便易行。本文簡(jiǎn)述該方法的應(yīng)用及發(fā)展前景。 1 時(shí)間分辨熒光分析法原理 在時(shí)間分辨熒光分析中使用的示蹤劑是鑭系離子如銪離子(Eu3+)、鋱離子(Tb3+)、鏑離子(Dy3+)。與傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記物相比，鑭系離子的標(biāo)記物具有斯托克斯位移大、熒光壽 命長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)較窄等特點(diǎn)，有利于降低本底和提高分析的靈敏度。 目前應(yīng)用于時(shí)間分辨熒光法的分析技術(shù)主要有三種類型(表1)，即 DElFIA系統(tǒng)（WALLAC公司)、 FIAgen系統(tǒng)(Cy-ber Fluor公司)和EALL系統(tǒng)。 DELFIA系統(tǒng)的特點(diǎn)為形成Eu3+ (

3、NTA)3(TOPO)3型的熒光復(fù)合物，其中NTA為2萘酰三氟丙酮，TOPO為三辛基氧化磷。Eu3+螯合劑(聚羧酸型)標(biāo)記的探針與靶DNA雜交后洗滌，低pH條件下,Eu3+可釋放出來(lái)與增強(qiáng)液中的NTA與TOPO結(jié)合形成最終的熒光復(fù)合物。在DNA分析中，該系統(tǒng)檢測(cè)的靈敏度為10-1810-16mol量的DNA探針。FIAgen系統(tǒng)所用的銪離子螯合劑為47二氯磺基苯1，l0鄰二氨雜菲2，9二羧酸(BCPDA)做標(biāo)記物與Eu3+螯合后團(tuán)相測(cè)量，避免了外源性Eu3+的污染。該系統(tǒng)應(yīng)用在生物素探針與BCPDA標(biāo)記的鏈親和素(SA)結(jié)合方面可取得滿意的檢測(cè)結(jié)果。常見(jiàn)的標(biāo)記SA所形成的復(fù)合物有三種，一為BC

4、PDA直接標(biāo)記SA形成復(fù)合物SA(BCPDA)，檢測(cè)靈敏度為10-1010-11molL；二為SA與標(biāo)記有160個(gè)BCPDA的甲狀腺球蛋白(TG)相連形成一個(gè)大分子的復(fù)合物SATG(BCPDA)160檢測(cè)靈敏度10-1110-12mol/L；三為活化的SATG(ECPDA)160復(fù)合物非共價(jià)連上兩個(gè)BCPDATG形成一個(gè)大分子復(fù)合構(gòu)(SBMC)，檢測(cè)靈敏度為10-1210-18mol/L。 EALI系統(tǒng)為酶促放大鑭系熒光系統(tǒng)，是以堿性磷酸酶為標(biāo)記物，底物為5氟水楊酸磷酸酯(5FASP)，底物水解后所生成的5FSA，在高PH條件下可與TbEDTA形成高強(qiáng)度的熒光復(fù)合物，即可進(jìn)行時(shí)間分辨熒光測(cè)定。

5、 應(yīng)用時(shí)間分辨熒光法進(jìn)行核酸雜交分析有兩種不同的形式，一種為斑點(diǎn)印邊雜交或在微孔條中進(jìn)行雜交分析。樣本核酸不必經(jīng)過(guò)電泳，直接點(diǎn)樣到濾膜或微孔中進(jìn)行雜交。常用DEFLIA系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，引入雜交體系中的Eu3+需釋放出來(lái)，與加入的增強(qiáng)液形成熒光復(fù)合物方可進(jìn)行檢測(cè)。另一種類型為Southern印跡雜交與Northern印跡雜交，特異核酸 的分子大小可通過(guò)凝膠電泳分開形成不同的DNA或RNA條帶，轉(zhuǎn)移固定到尼龍膜或硝酸纖維素膜上與Eu標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交分析。DELFIA系統(tǒng)由于需加增強(qiáng)液檢測(cè)，無(wú) 法定位電泳條帶，不適于進(jìn)行Northern印跡雜交與Southern印跡雜交分析。在FIAgen系統(tǒng)與

6、EALL系統(tǒng)中，引入到雜交體系的Eu3+螯合物即為熒光復(fù)合物，無(wú)需加增強(qiáng)液即可用時(shí)間分辨熒光掃描儀進(jìn)行分析。在Southern和Northern印跡雜交技術(shù)中能準(zhǔn)確定位并檢測(cè)特異的DNA或RNA電泳條帶。 2 鑭系離子標(biāo)記核酸探針檢測(cè)DNA雜交技術(shù) 鑭系離子標(biāo)記核酸探針是八十年代末發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)它克服了放射性核素標(biāo)記的半衰期短、放射性危害等缺點(diǎn)越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于核酸雜交分析，是迄今最為理想的一種非放射性檢測(cè)方法?，F(xiàn)將幾種鑭系離子標(biāo)記DNA探針及檢測(cè)方法簡(jiǎn)述如下。 21 免疫化學(xué)測(cè)定法 Syvanen應(yīng)用TRF發(fā)展了一種斑點(diǎn)雜交(dot blot)技術(shù)。該法是用半抗原AAIF(7碘N乙酸基N2

7、乙酸氨茁)或Sulfone(礬)修飾DNA探針，與固定在硝酸纖維素膜上靶DNA雜交，而后用二步免疫法檢測(cè)，先加入抗半抗原抗體與半抗原結(jié)合，再加Eu3+標(biāo)記的第二 抗體IgGDTPAEu3+進(jìn)行檢測(cè)。最小可測(cè)值為20pgAd2 DNA，相當(dāng)于5×105個(gè)分子。 22 生物素鏈親和素BAS法Dehlen 將生物素鏈親和素系統(tǒng)引入TRF中，簡(jiǎn)稱BASTRF法。用PBSIA緩沖液將變性的Ad2DNA稀釋至適宜濃度，取100ul加至微孔條中室溫過(guò)夜，洗二次，250uW/cm2、254nm紫外燈下照射5min。預(yù)雜文后，每孔加 入100ul（100ngml）通過(guò)缺口轉(zhuǎn)移法制得的生物素在Ad2 D

8、NA探針雜交、洗滌，加200ul2ugmlSA異硫氰酸苯基EDTAEu3+，室溫培育,1h后洗滌。每孔加入200ul增強(qiáng)溶液進(jìn)行測(cè)量。線性范圍為10pg10ng，變異系數(shù)在 5以下，分析靈敏度為10pg Ad2 DNA。Dahlen等還發(fā)現(xiàn)以?shī)A心雜交反應(yīng)代替上述直接雜交方法可提高檢測(cè)靈敏度。他們用Eu3+SA及夾心雜交法檢測(cè)大腸桿菌DNA靈敏度達(dá)1.9pg。夾心雜交法需要兩個(gè)相鄰但不重疊的探針，個(gè)是固定吸附探針；另個(gè)是生物素標(biāo)記檢測(cè)探針。將吸附探針固定在微孔條中，與靶DNA雜交后，再加入生物素化探針進(jìn)行雜交。這樣，經(jīng)過(guò)二個(gè)步驟雜交反應(yīng)形成吸附DHA探針-靶DNA-生物素化DNA探針的夾心結(jié)構(gòu)，

9、再用Eu3+SA檢測(cè)。該法中，待測(cè)樣品不必經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的純化處理，檢測(cè)方法快捷、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定和靈敏。 2.3 Eu3+ 化學(xué)直接標(biāo)記法 DNA分子中的胞嘧啶堿基在PH6的亞硫酸鈉溶液中可與乙二胺發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，使DNA分子摻入一個(gè)活化氨基基團(tuán)可與Eu3+螯合物共價(jià)結(jié)合形成Eu3+DNA熒光標(biāo)記物。Eu3+螯合劑為一種異硫氰酸鹽的衍生物4-2(4異硫氰酸基)乙基-2，6-雙N，N雙(羧甲基)氨乙基吡啶。 Eu3+直接標(biāo)記DNA的比率，與轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的程度有關(guān)。 DNA在45時(shí)，轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)2h，Eu3+標(biāo)記率為5的核苷酸；在98時(shí)，轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)7min、Eu3+。標(biāo)記率可達(dá)10%。Eu3+直接標(biāo)記核酸探針會(huì)

10、干擾雜交時(shí)的堿基配對(duì)，導(dǎo)致雜交效率下降。但通過(guò)提高雜交體系中的探針濃度，仍可獲得滿意效果。此法可應(yīng)用于夾心雜交分析及斑點(diǎn)雜交分析，可測(cè)范圍為10100pgDNA。 24 酶放大時(shí)間分辯熒光法EALL 將靶DNA固定到微孔條表面，各孔，加100ul(125ng/L)生物素化探針，雜交、洗滌、加入濃度為5gL的脫脂奶粉封閉再加濃度為500ugL堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的親和素(AP-avidin)，培育后洗滌去除游離的AP，加入5-氟水楊酸磷酸酶(5-FSAP)底物液，培育2h，即脫去磷酸，生成5-FSA，可與Tb3+-EDTA螯合物形成熒光復(fù)合物，即可用時(shí)間分辨熒光顯相儀系統(tǒng)測(cè)量。最小檢測(cè)值為3p

11、g。此法還可以用尼 龍膜做固相載體進(jìn)行斑點(diǎn)雜交分析和Southern印跡雜交分析。 2.5 Psoralen介導(dǎo)的銪標(biāo)記方法Oser等用一種新的方法標(biāo)記DNA探針，將一個(gè)質(zhì)?？寺〉奶结樣孟拗菩詢?nèi)切酶消化成部分單鏈，載體部分保持雙鏈狀態(tài)。富含疏基基團(tuán)的補(bǔ)脂骨素衍生物psoralen在紫外燈下可與呈雙鏈的載體DNA共價(jià)結(jié)合，DTPA通過(guò)多聚的L賴氨酸(pLL)與psoralen結(jié)合，最后形成復(fù)合物Eu3+-DTPA-pLL-psora1en。這種用psora1en介導(dǎo)的Eu 3+標(biāo)記核酸探針?lè)椒?，由于探針雜交區(qū)域未被修飾，雜交效率較高。雜交區(qū)域的DNA序列呈單鏈狀態(tài)，無(wú)需在雜交前變性處理DNA，還

12、可阻止雜交反應(yīng)中DNA探針的自身重組而導(dǎo)致的雜交效率下降。3 鑭系離子標(biāo)記的PCR技術(shù)近年來(lái)，時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合用于檢測(cè)特異的靶DNA序列，該技術(shù)簡(jiǎn)稱為PCRTRF31 嵌套式PCRTRF法 嵌套式(nested) PCRTRF法的原理是在擴(kuò)增特定的靶DNA序列之前，先設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其中一對(duì)為普通引物，另一對(duì)引物嵌套在兩個(gè)普通引物之間，分別標(biāo)記有Eu 3+和生物素。DNA擴(kuò)增分兩步進(jìn)行，第一步稱為PCRI，以普通引物擴(kuò)增，第二步稱為PCRII，以Eu 3+和生物素標(biāo)記的一對(duì)引物對(duì)PCRI的產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。二步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物收集在包被有SA的微滴板中，進(jìn)行時(shí)間分辨熒光檢測(cè)。Da

13、hlen等按照比方法對(duì)HIVI cos l011DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCRI反應(yīng)為25個(gè)循環(huán)，PCRII；反應(yīng)為10個(gè)循環(huán)，可檢測(cè)到5個(gè)拷貝的靶DNA、線性范圍為550個(gè)拷貝。 該方法可用來(lái)檢測(cè)某些改變交了限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的堿基突變。例如，鐮形細(xì)胞貧血病是由于B-球蛋白基因的第6密碼子中的堿基A突變?yōu)門而引起的遺傳性疾病。這種點(diǎn)突變同時(shí)也改變了D6e I酶切位點(diǎn)，使突變的DNA不能被Dde I酶切，而正常人的DNA可按Dde I酶切。這樣兩步擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物固定到微板孔中后加入Dde I酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，洗滌后，TRF檢測(cè)，正常人僅得背景信號(hào)，雜合體的測(cè)量值為純合體的一半。嵌套式PCRTRF法

14、具有特異性強(qiáng)，靈敏度高的特點(diǎn)。這是由于PCRI中非特異擴(kuò)增的DNA片段在PCRII中不可能得到進(jìn)一步擴(kuò)增，并且PCRII中僅擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，即使有非特異性擴(kuò)增，也是極微量的。PCR與TRF兩種超微量分析方法相結(jié)合，極大地提高了靈敏度。32 雙標(biāo)記PCR法 該法主要用于基因缺失的疾病診斷。由于不同的鑭系離子(Eu 3+，Tb 3+，Sm 3+)螯合物的熒光發(fā)射蜂的波長(zhǎng)不同，可分別利用不同波長(zhǎng)測(cè)量時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度。在同一雜交反應(yīng)中，應(yīng)用兩種不同鑭系離子Eu 3+，Sm 3+標(biāo)記DNA探針。該探針為等位基因特異的探針，可同時(shí)檢測(cè)PCR產(chǎn)物中兩個(gè)不同的等位基因，稱為雙標(biāo)記TRFPCR法，簡(jiǎn)稱DLTRF

15、-PCR(dual-1abel TRF-PCR)。Litio等對(duì)囊性纖維病變的突變基因與正?；蜻M(jìn)行DLTRFPCR分析。該病在一個(gè)138bp長(zhǎng)的區(qū)域內(nèi)缺失了AF 508位點(diǎn)。因此，他在缺失區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)了一個(gè)由sM34標(biāo)記的等位基因特異探針，并用Eu3f標(biāo)記正常等位基因特異的探針，在等位基因外設(shè)計(jì)一個(gè)生物素標(biāo)記的共同探針。實(shí)驗(yàn)中首先將靶DNA按標(biāo)準(zhǔn)程序擴(kuò)增后，再與上述三種探汁同時(shí)雜交。所有的PCR產(chǎn)物均可結(jié)合上生物素化探針，結(jié)合在包被有SA的微孔條中。在正?；蛏想s交結(jié)合探針為Eu 3+標(biāo)記的，雜合子的基因上結(jié)合的探針為Sm 3+標(biāo)記、Eu 3+標(biāo)記兩種探針，純合子的基因上僅結(jié)合上Sm 3+標(biāo)記

16、的探針。分別用Eu 3+、Sm 3+不同的發(fā)射光譜測(cè)定各自的熒光計(jì)數(shù)，可篩查出囊性纖維病的雜合子與純合子。33 TRFSPCR直接定量法Diamandis介紹了一種在凝膠中直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量的方法。該方法是在一個(gè)PCR引物的5端標(biāo)記上BCPDA。 PCR擴(kuò)增后，凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，然后將膠浸入到一種含有Eu 3+的溶液中，在浸泡過(guò)程中Eu 3+可擴(kuò)散到膠內(nèi)，與BCPDA結(jié)合形成熒光復(fù)合物。用一種特別的時(shí)間分辨熒光掃描儀進(jìn)行定量分析。該技術(shù)稱為時(shí)間分辨熒光掃描(TRFS)PCR技術(shù)，簡(jiǎn)稱TRFSPCR直接定量法。34 其它的PCRTRF法LiLio(1992)用PCRTRF法檢測(cè)HTL

17、VI和 HTLYII (human T lymoPhotropic viruresI and II)，他的方法是分別擴(kuò)增兩種病毒的基因組DNA，再與Eu2?標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交，TRF方法檢測(cè)。Dahlen(1993)用與此類似的方法檢測(cè)出。-抗胰蛋白缺乏癥的PIZ基因。4 結(jié)束話 DNA探針雜交技術(shù)與PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究以及臨床各種傳染病、遺傳病、癌癥等疾病診斷均是一項(xiàng)強(qiáng)有力的手段。用時(shí)間分辨熒光法檢測(cè)鑭系離子標(biāo)記的核酸探針和PCR產(chǎn)物，集快速、簡(jiǎn)便、高靈敏度、安全為一體，并可進(jìn)行自動(dòng)化分析，是目前最理想的一種非同位素標(biāo)記測(cè)定方法。 這項(xiàng)新技術(shù)已引起生物工作者的廣泛重視。我國(guó)雖然起步較晚，但