生物氧化產(chǎn)堿去除半纖維素水解物中的有機酸

1、生物氧化產(chǎn)堿去除半纖維素水解物中的有機酸劉勝男1,2 覃香香1 張厚瑞1* 蔡愛華1 林蘭英2(1. 中國科學院廣西植物研究所 廣西 桂林 541006)(2. 廣西師范大學生命科學學院 廣西 桂林 541004)摘 要: 盔形畢赤酵母Pichia galeiforms B-10對半纖維素水解物中的有機酸具有良好的降解活性, 影響它脫酸活性的最主要因素是水解物初始pH。將半纖維素水解物初始pH值調(diào)節(jié)至5.0以上而無需其他處理, Pichia galeiforms B-10便可發(fā)揮良好的脫酸發(fā)酵性能。Pichia galeiforms B-10代謝有機酸鹽可產(chǎn)生堿性物質(zhì), 使水解液pH升高。在

2、pH值5.0的條件下, 只要調(diào)節(jié)補酸(補加低pH值水解物)的速率與代謝耗酸速率相平衡, 發(fā)酵體系即可始終處于有利于酵母快速代謝有機酸的高pH環(huán)境。這種生物氧化產(chǎn)堿連續(xù)脫酸發(fā)酵方式, 可有效降低中和半纖維素水解物的外加用堿量, 具有降低成本, 減少新污染物的優(yōu)勢。關(guān)鍵詞: 半纖維素水解物, 生物氧化產(chǎn)堿, 有機酸Removal of Organic Acid from HemicelluloseHydrolysate by Bio-oxidation to Produce AlkaliLIU Sheng-Nan1,2 QIN Xiang-Xiang1 ZHANG Hou-Rui1* CAI Ai

3、-Hua1LIN Lan-Ying2(1. Guangxi Institute of Botany, Chinese Academy of Science, Guilin, Guangxi 541006, China)(2. Life Science College, Guangxi Normal University, Guilin, Guangxi 541004, China)Abstract: Pichia galeiforms B-10 has a good ability to degrade organic acid in hemicellulose hydrolysate, an

4、d this depickling activity of the strain is mainly affected by the initial pH value of hydrolysate. If the initial pH value of hemicellulose hydrolysate was adjusted above 5.0, Pichia galeiforms B-10 would exhibit an excellent capability of depickling fermentation without any other treatment. During

5、 the metabolism of organic acid salt by Pichia galeiforms B-10, alkali products were generated and this caused the raising of pH value. Therefore, under the condition of pH > 5.0, if only the acid supplying speed (by adding hydrolysate with low pH value) was adjusted to be in balance with the aci

6、d metabolizing speed, the fermentation system would always be kept in a high pH circumstance which was advantageous to the metabolism of organic acid by yeast. This mode, by using biooxidation to produce alkali for the continuous depickling fermentation, effectively reduced the addition of alkali du

7、ring the neutralization of hemicellulose hydrolysate, and finally lowered the processing cost and generated less pollutant.Keywords: Hemicellulose hydrolysate, Bio-oxidation to produce alkali, Organic acid木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源, 主要由纖維素、半纖維素與木質(zhì)素組成。半纖維素約占其總量的20%30%, 它很容易被稀酸水解生成以木糖(五碳糖)為主要成分的半纖維素水解物, 可用于發(fā)酵

8、生產(chǎn)木糖醇、燃料乙醇等一系列化工產(chǎn)品12。但是稀酸水解半纖維素生成可發(fā)酵性糖的同時, 會伴隨生成一系列有機酸, 其中以醋酸為主要成分, 還包括少量的甲酸、丙酸、丁酸、苯甲酸和異戊酸35在內(nèi)的對微生物代謝有毒的副產(chǎn)物, 影響發(fā)酵過程。要改善半纖維素水解物的發(fā)酵性能, 必須除去這些有機酸67。除去半纖維素水解液中以醋酸為主的有機酸, 已經(jīng)報道的方法有活性炭吸附8、胺抽提9、離子交換膜10、電滲析11和離子排斥12等。不過, 半纖維素水解物的理化脫酸由于成本高或因產(chǎn)生新的污染物而限制了其實際應(yīng)用的潛力。許多酵母可以利用醋酸為唯一碳源生長, 因此利用代謝醋酸的酵母可以實現(xiàn)半纖維素水解物脫酸。Henry

9、 Schneider3等曾利用一株釀酒酵母糖類營養(yǎng)缺陷突變體除去亞硫酸鹽硬木制漿廢液中的醋酸, 但是他所用的酵母具有易復性的缺點。林蘭英13發(fā)現(xiàn), 盔形畢赤酵母(Pichia galeiforms)可利用多種有機酸, 不僅對半纖維素水解物具有很強的脫酸活性, 且不代謝其中的木糖。本文進一步研究以 Pichia galeiforms B-10為生物脫酸菌株, 研究了影響半纖維素水解物生物脫酸的主要因素, 探討其適宜的生物脫酸條件, 以期為半纖維素水解物生物脫酸工藝的建立提供更充分的科學依據(jù)。 1 材料與方法1.1 供試菌株供試菌株P(guān)ichia galeiforms B-10, 本實驗室從纖維水解

10、工廠環(huán)境分離, 它在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC M 209245, 普通麥芽汁培養(yǎng)基斜面培養(yǎng), 4°C保存。1.2 種子培養(yǎng)培養(yǎng)基配方(g/L): 葡萄糖50, 酵母膏5, MgSO4·7H2O 1, KH2PO4 1, NH4NO3 3, CaCl2 0.2。滅菌條件: 糖、鹽分開滅菌, 1 × 105 Pa, 滅菌20 min。250 mL三角瓶裝液體培養(yǎng)基50 mL, 接種一環(huán)斜面培養(yǎng)物, 200 r/min、30°C搖床培養(yǎng)24 h。1.3 半纖維素水解物制備干燥的蔗渣按固 : 液 = 1 : 3.5與1% HCl混合, 蒸汽壓

11、力0.18 MPa/cm2水解40 min。壓濾收集水解液, 用10% KOH調(diào)節(jié)至pH 3.0, 抽濾去除沉淀, 即得半纖維素水解物。這種水解物的可溶性固形物含量為8.5%, 其中木糖含量78.9% (W/W)。4°C冷藏, 使用時按要求進一步處理。1.4 水解物預處理真空蒸發(fā): 水解物用 R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士, Buchi) 75°C真空蒸發(fā)濃縮至1/2體積, 以除去其中的揮發(fā)性物質(zhì)。濃縮過的水解物再用去離子水稀釋, 還原至原體積。活性炭吸附: 按100 mL水解物加入粉末活性炭0.19 g (GA-T1, 江西懷玉山三達活性炭有限公司), 50°C恒溫

12、條件下攪拌60 min, 抽濾去除活性炭粉末, 得活性炭吸附處理水解物。pH值調(diào)節(jié): 制備好的pH 3.0的水解物, 或經(jīng)真空蒸發(fā)、活性炭吸附處理過的水解物, 再用10% KOH分別調(diào)至要求的pH值, 過濾去除調(diào)節(jié)pH所產(chǎn)生的沉淀, 用于考察不同預處理與pH值調(diào)節(jié)聯(lián)合效應(yīng)。1.5 氧化脫酸發(fā)酵條件通氣量: 250 mL三角瓶按不同裝液量加入蔗渣水解物, 按2% (V/V)種量接入新鮮的種子液, 30°C、200 r/min搖瓶培養(yǎng)60 h, 通過不同裝液量評估通氣量對生物脫酸效果的影響。連續(xù)脫酸發(fā)酵: 250 mL三角瓶、裝液量50 mL, 水解液初始pH 5.0, 接種量2% (V

13、/V), 30°C、200 r/min搖床培養(yǎng)。待發(fā)酵液pH升至一定值后, 從搖瓶中移出總體積10%的發(fā)酵液, 沉淀離心收集細胞, 并用相同體積pH 3.0的新鮮水解液調(diào)勻收集的細胞, 一起返回搖瓶。通過進、出料的體積和速率調(diào)節(jié)維持發(fā)酵液處于要求的pH范圍。1.6 檢測方法細胞干重: 離心發(fā)酵液收集菌體, 去上清液。沉淀反復用去離子水洗滌3次, 加水至原體積, 依次取1、2、3、4、5 mL加水定容至11 mL, 分別取1 mL稀釋100倍, 于T6紫外可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)利用比濁法測定600 nm處吸光值。剩余10 mL菌體離心, 于85°C烘箱中

14、干燥至恒重。菌體干重為縱坐標, 以菌體稀釋100倍吸光值(OD600)為橫坐標, 繪出細胞干重標準曲線。測定發(fā)酵液OD值, 通過標準曲線換算出細胞干重。糖類: HPLC法, 510色譜儀, 410示差折光檢測器(美國, Waters), BC-100 Ca2+碳水化合物柱(美國, BENSON)。檢測條件: 超純水0.5 mL/min, 柱溫85°C, 進樣量20 L?？傆袡C酸: pHS-2C型精密酸度計(上海雷磁儀器廠), 使用前校正。測定水解液的pH, 以其變化情況代表總有機酸量的變化, pH上升表示有機酸被消耗。醋酸: Agilent 1100 HPLC色譜儀, 色譜柱, Sy

15、mmetry 5 m C18柱, 柱溫為室溫, 流動相為甲醇 : 0.2%磷酸 = 1 : 3, 流速為1.0 mL/min, 二極管陣列紫外檢測器。進樣量: 10 L, 檢測波長: 198 nm。2 結(jié)果與分析2.1 不同預處理對生物脫酸的促進作用 真空蒸發(fā): 真空蒸發(fā)(濃縮因子: 2)過程產(chǎn)生的冷凝液所含主要揮發(fā)性物為糠醛, 以及少部分醋酸(圖1)。無論未經(jīng)真空蒸發(fā)的水解物, 還是經(jīng)過真空蒸發(fā)之后再用水還原回蒸發(fā)前體積的蒸發(fā)處理水解物, 提高初始pH值都是Pichia galeiforms B-10獲得高細胞增長速率的最主要因素。雖然在初始pH值3.0、4.0的條件下, 蒸發(fā)處理水解物的細

16、胞密度略高于不經(jīng)真空蒸發(fā)水解物的細胞密度, 但增加的幅度 < 10%。當初始pH值提高至5.0, 則兩者之間的細胞密度幾無差異。顯然, 只要將水解物的初始pH值調(diào)節(jié)至5.0左右, 即可基本消除其中揮發(fā)性有毒成分對Pichia galeiforms B-10細胞生長的抑制作用(圖2), 而不必再對水解物進行蒸發(fā)濃縮處理。圖1 蔗渣水解物蒸發(fā)冷凝液HPLC圖譜Fig. 1 HPLC analysis of bagasse hydrolysate evaporation condensate注: 1: 醋酸; 2: 糠醛.Note: 1: Acetic acid; 2: Furfural.圖2

17、 蒸發(fā)處理蔗渣水解液對酵母細胞生長的影響Fig. 2 The effect of evaporation of bagasse hydrolysate on the growth of yeast cells無論水解物是否經(jīng)過真空蒸發(fā)處理, 在初始pH值3.0的條件下接種Pichia galeiforms B-10, 發(fā)酵48 h之后細胞干重均升高至5 g或1.5個單位(圖3)。初始pH值3.0的條件下, Pichia galeiforms B-Pichia galeiforms B-圖3 蒸發(fā)處理對水解物發(fā)酵液pH變化的影響Fig. 3 The effect of evaporation o

18、n the pH change of hydrolysate fermentation broth 活性炭吸附: 利用活性炭吸附處理蔗渣水解物, 可以去除一部分水解液中的有毒物質(zhì), Pichia galeiforms B-10細胞在其中的生長情況略好于未經(jīng)活性炭吸附的水解物, 但是與蒸發(fā)處理水解液的情況類似, 提高初始pH值才是Pichia galeiforms B-10獲得高細胞增長速率(圖4)和加速脫酸過程(圖5)的最主要因素。將水解液初始pH調(diào)節(jié)至5.0, 活性炭處理已經(jīng)沒有明顯提高發(fā)酵液的細胞密度和有效促進脫酸過程的作用。顯然, 對于Pichia galeiforms B-10的脫酸發(fā)

19、酵而言, 將水解液初始pH調(diào)節(jié)至5.0之后不必再進行活性炭預處理。圖4 活性炭吸附處理蔗渣水解物對酵母細胞生長的影響Fig. 4 The effect of active carbon adsorption of bagasse hydrolysate on the growth of yeast cells圖5 活性炭吸附對水解物發(fā)酵液pH變化的影響Fig. 5 The effect of active carbon adsorption of bagasse hydrolysate on the pH change of fermentation broth2.2 水解物發(fā)酵液醋酸含量的變

20、化半纖維素水解物的有機酸以醋酸為主, Pichia galeiforms B-10脫酸發(fā)酵前HPLC檢測的醋酸峰明顯(圖6A), 發(fā)酵后醋酸峰幾乎完全消失(圖6B)。初始pH 5.0的水解物經(jīng)脫酸發(fā)酵后可升至pH 8.0 (圖3, 圖5)左右。堿性的環(huán)境條件表明: Pichia galeiforms B-10已經(jīng)代謝除去水解物中以醋酸為主的有機酸。根據(jù)HPLC檢測脫酸前后醋酸減少量4.7 g/L。圖6 發(fā)酵前后蔗渣水解物中醋酸含量的變化Fig. 6 The content variation of acetic acid in bagasse hydrolysate before and af

21、ter fermentation注: A: 發(fā)酵前; B: 發(fā)酵后; 1: 醋酸.Note: A: Before fermentation; B: After fermentation; 1: Acetic acide.2.3 水解物生物脫酸過程的糖分變化蔗渣半纖維素水解物中主要糖類包括D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖, 其中葡萄糖占總糖的6.5%, 木糖占78.9%, 阿拉伯糖占11.5%左右(圖7)。接種Pichia galeiforms B-10之后, 水解物的葡萄糖被消耗(圖7B), 隨后有機酸被消耗(圖6B), 培養(yǎng)基pH上升(圖3, 圖5)。但即使經(jīng)過很長時間的培養(yǎng), 水解物中的

22、木糖, 阿拉伯糖, 以及其他一些未知成分的雜糖始終未見被消耗的跡象(圖7B)。顯然除葡萄糖外, Pichia galeiforms B-10對半纖維素水解物中葡萄糖之外的糖類均缺乏同化利用的能力。用Pichia galeiforms B-10除去水解物中的有機酸, 不會造成主要糖類的損失。 圖7 蔗渣水解物發(fā)酵前后的不同糖類的含量變化Fig. 7 The content variation of sugar components in bagasse hydrolysate before and after fermentation注: A: 發(fā)酵前; B: 發(fā)酵后; 1: 葡萄糖; 2: 木

23、糖; 3: 阿拉伯糖.Note: A: Before fermentation; B: After fermentation; 1: D-glucose; 2: D-xylose; 3: L-arabinose.2.4 通氣量對脫酸速率的影響純凈的有機酸鉀鹽呈堿性, 接種后水解液培養(yǎng)基升至pH 7.0意味著其中的分子態(tài)有機酸已經(jīng)消耗完畢。在初始pH 5.0的條件下, 在試驗裝料量范圍內(nèi), 裝料量越少, 即通氣量越大, Pichia galeiforms B-10耗酸的速度越快(圖8)。250 mL三角瓶裝液量由25 mL提高至150 mL, 培養(yǎng)基至pH 7.0所需要的時間由15 h延長至60

24、 h左右。伴隨著通氧量的增大脫酸速度逐漸加快, 主要是高的通氣水平為細胞增殖提供了足夠的氧, 加快了細胞增殖速率, 從而縮短了脫酸時間。圖8 搖瓶不同裝液量與蔗渣水解物發(fā)酵液pH變化的關(guān)系Fig. 8 The relationship between the medium loading of shake-flask and the pH change of bagasse hydrolysate fermentation broth2.5 連續(xù)脫酸發(fā)酵搖瓶裝料量50 mL條件下, pH 5.0的蔗渣半纖維素水解物經(jīng)Pichia galeiforms B-10脫酸發(fā)酵24 h, 發(fā)酵液pH值升

25、至7.0, 表明脫酸完全(圖3、5、8)。移出裝料量體積10% (5 mL)的發(fā)酵液, 離心收集沉淀細胞, 用5 mL, pH 3.0的水解物調(diào)勻細胞并返回搖瓶, 約12 h后可再次升至7.0。繼續(xù)按前述方法移出發(fā)酵液, 收集細胞, 及用新鮮的水解液調(diào)勻沉淀細胞并返回搖瓶, 如此循環(huán)利用細胞, 補料脫酸10次, Pichia galeiforms B-10的脫酸速率未見下降, 隨補料批次增加, 細胞密度增大, 脫酸時間呈不斷縮短的趨勢(圖9)。圖9 循環(huán)利用細胞補料發(fā)酵批次與脫酸效率的關(guān)系Fig. 9 The relationship between the fed-batch of recy

26、cle cell fermentation and the efficiency of acid removal提高初始pH可降低半纖維素水解物中有機酸對Pichia galeiforms B-10的抑制作用, 提高細胞增長速率(圖2), 改善脫酸效果(圖3), 但以堿液直接中和有機酸提高初始pH值的方法, 不僅提高成本, 而且加入的堿金屬離子最終將成為環(huán)境污染物。Pichia galeiforms B-10代謝有機酸鹽的過程中, 首先是氧化有機酸根生成CO2, CO2再與金屬離子(本實驗主要為鉀離子)作用生成碳酸鹽, 使發(fā)酵液的pH升高。當水解物的pH升高至一定值之后再流加低pH值的水解物,

27、 只要調(diào)節(jié)補料加酸速率與氧化產(chǎn)堿的速率相平衡, 則發(fā)酵體系可長期穩(wěn)定于快速脫酸的高pH狀態(tài)。本質(zhì)上, 這是利用生物氧化有機酸鹽產(chǎn)生的堿性物質(zhì), 提高水解物的pH值, 使酵母始終處于快速代謝有機酸的高pH環(huán)境。生物氧化產(chǎn)堿代謝特性的利用, 可以大量節(jié)約調(diào)節(jié)水解物pH的外加用堿量, 使脫酸發(fā)酵更為經(jīng)濟、便捷、環(huán)保。3 討論盔形畢赤酵母Pichia galeiforms B-10可有效代謝半纖維素水解物中的有機酸, 影響它脫酸發(fā)酵活性的最主要因素是水解物初始pH值。將蔗渣半纖維素水解物初始pH值調(diào)節(jié)至5.0以上, 不經(jīng)其它任何處理Pichia galeiforms B-10即可發(fā)揮良好的生物脫酸發(fā)酵

28、活性。Pichia galeiforms B-10對半纖維素水解物進行脫酸發(fā)酵不會造成主要糖類的損失。Pichia galeiforms B-10對半纖維素水解物進行脫酸發(fā)酵, 即使脫酸完全, 水解物發(fā)酵液pH升至堿性條件也不會利用其中的木糖、阿拉伯糖等主要糖類, 使它們得到有效保存。Pichia galeiforms B-10代謝有機酸鹽產(chǎn)生堿性物質(zhì), 利用這一特性可大量節(jié)約調(diào)節(jié)水解物pH值的外加用堿量。Pichia galeiforms B-10氧化代謝水解物中的有機酸, 發(fā)酵體系pH升高至一定值(pH 5.0)之后, 可直接流加低pH (約為pH 3.0)的水解液進行脫酸發(fā)酵。尤其是,

29、只要調(diào)節(jié)發(fā)酵體系的補料加酸速率與代謝耗酸速率相平衡, Pichia galeiforms B-10細胞即可長時間維持于能快速代謝有機酸的高pH狀態(tài)。這種生物氧化產(chǎn)堿連續(xù)脫酸發(fā)酵方式, 有效解決了水解物生物脫酸需要在較高pH值條件下進行, 與調(diào)節(jié)pH值的用堿最終將成為環(huán)境污染物, 并提高生物脫酸成本的矛盾, 使半纖維素水解物的生物脫酸工藝更加經(jīng)濟、環(huán)保。參 考 文 獻1 龔霄, 賀稚非, 陳盼, 等. 發(fā)酵法生產(chǎn)木糖醇研究進展. 糧食與油脂, 2008(3): 4448.2 王曉娟, 王斌, 馮浩, 等. 木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)制備生物乙醇研究進展. 石油與天然氣化工, 2007, 36(6): 4

30、52461.3 Schneider H. Selective removal of acetic acid from hardwood-spent sulfite liquor using a mutant yeast. Enzyme and Microbial Technology, 1996, 19(2): 9498.4 Larsson S, Palmqvist E, HahnHagerdal B, et al. The generation of fermentation inhibitors during dilute acid hydrolysis of softwood. Enzyme and Microbial Technology, 1998, 24(3/4): 151159.5 Naoyuki O, Mayumi S, Kazuaki N, et al. Biological detoxification of waste house wood hydrolysate using Ureibacillus thermospHaericus for bioethanol production. Journal of Bi