RedET重組及其在生物醫(yī)學中的應(yīng)用解析

1、21卷3期2005年5月生物工程學報Chinese Journal o f Biotechnology V ol. 21N o. 3May 2005R ed ET 重組及其在生物醫(yī)學中的應(yīng)用R ed ET R ecombination and its Biomedical 王軍平13, 張友明2W ANGJun 2Ping 13and ZH ANG Y ou 2Ming 211, 重慶40003821基因橋研究室, 11State K ey Laboratory o f , and Injury , Institute o f Combined Injury , College o f Pre

2、ventive Medicine , The Third Military MedicalUniver sity , Chongqing 400038, 21G ene Bridge G mbH , Dresden 01307, G ermany系統(tǒng)而建立的DNA 工程平臺摘要通過應(yīng)用Rac 噬菌體的RecE RecT 和噬菌體的Red Red Red ET 重組, 是一種不依賴于限制性內(nèi)切酶的分子克隆新技術(shù)。運用該技術(shù)能夠介導PCR 產(chǎn)物或寡核苷酸對目標基因進行剪切、插入、融合及突變等多種操作, 在生物醫(yī)學領(lǐng)域里具有廣闊的應(yīng)用前景, 尤其在基因組功能研究中對BACs 、PACs 和細菌染色體

3、的打靶修飾以及基因敲除動物DNA 靶分子的快速構(gòu)建等方面最有效。隨著Red ET 重組的推廣與應(yīng)用, 該技術(shù)本身也在不斷被改進, 在工作效率得到顯著提高的同時, 其操作也變得更加簡單、省時、省力。結(jié)合自身的一些研究結(jié)果, 對Red ET 重組的技術(shù)特點、發(fā)展現(xiàn)狀和在生物醫(yī)學中的應(yīng)用進行了詳細闡述。關(guān)鍵詞Red ET 重組, DNA 修飾, BACs , 噬菌體中圖分類號Q78文獻標識碼A 文章編號100023061(2005 0320502205Abstract Red ET recombination , a powerful hom olog ous recombination syste

4、m based on the Red operon of phage or RecE RecT from Rac phage , provides an innovative approach for DNA engineering. Deletion , insertion and mutation can be quickly and precisely performed on the target gene mediated by Red ET recombination with PCR derived DNA fragments or olig onucleoti 2des. Th

5、is technical platform has extensive applications in biomedical field including bacterial artificial chrom osome m odification , gene knock 2out construction and genetic m odification of E . coli strains as well as some other kinds of m icroorganisms. Recently , Red ET recombination was im proved in

6、several aspects so that it becomes m ore powerful and maneuverable. The characteristic and development of Red ET recombination and its biomedical applications were described in this review. K ey w ords Red ET recombination , DNA m odification , bacterial artificial chrom osomes , phage隨著包括人類基因組計劃在內(nèi)的

7、各種基因組測序工程的實施與完成, 以序列信息為基礎(chǔ)的基因組功能研究隨即成為生命科學領(lǐng)域的又一重大課題1。相對于測序工程, 基因組的功能研究就更加復雜和困難。對于某一特定基因, 要想徹底了解其生物學作用, 往往需要對包含基因完整信息的基因組DNA 進行克隆、刪除、突變等多種修飾, 從而為后續(xù)的表達和功能研究奠定基礎(chǔ)。一般情況下, 一個完整的哺乳動物基因包括內(nèi)含子、外顯子以及啟動子等調(diào)控元件在內(nèi)的全長DNA 序列都在幾十甚至上百個kb , 另外, 還有很多基因是以基因簇形式存在。這種包含完整基因信息的基因組DNAReceived :December 29, 2004; Accepted :M ar

8、ch 4, 2005.This w ork was supported by grants from The National Natural Sciences F oundation of China (N o. 30230360 and The T M M U F oundation for returnee.3C orresponding author. T el :86223268752283; E 2mail :wangjunp yahoo. com國家自然科學基金資助項目(N o. 30230360 , 第三軍醫(yī)大學留學回國人員啟動資金資助。王軍平等:RedET 重組及其在生物醫(yī)學

9、中的應(yīng)用通常是經(jīng)過建庫方式被裝載于BACs (bacterial artificial chro 2m os omes 或PACs (P1artificial chrom os omes 等大容量載體503PCR 將同源臂直接加在供體打靶片段的兩側(cè)。經(jīng)RecE RecT介導, 兩端帶有同源臂的供體分子就能直接插入到受體DNA 靶分子的同源區(qū)部位。通過改變同源臂的區(qū)域和它們中間的打靶序列, 人們就可以達到對DNA 靶分子進行插入、剪切等多種目的。同理, 如果將50bp 的同源臂放在線性質(zhì)粒載體的兩端, 通過該系統(tǒng)還可直接克隆或亞克隆DNA 靶分子。由于同源臂可以人為選擇, 和DNA 分子大小的限

10、制, ET 克隆可以對任意大的DNA 中2, 3。對如此大的DNA 分子, 此時很難應(yīng)用PCR 和限制酶等傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)對其進行修飾。另外, 由于限制性內(nèi)切酶和PCR 都是在體外(in vitro 對DNA 分子進行操作, 所以堿基的無謂突變也常常困擾著實驗的正常進行。正是在這種情況下, 一種基于噬菌體同源重組系統(tǒng)的Red ET 重組技術(shù)應(yīng)運而生, 通過該技術(shù)可以簡單、快速地對任意大的DNA 分子進行各種修飾, 由于重組反應(yīng)的整個過程都是在大腸桿菌細胞內(nèi)部完成, 因此就不存在堿基突變的危險, 從而為基因功能研究提供了一個有效的前期操作平臺。本文結(jié)合我們自己的工作經(jīng)驗, 對Red ET 原理、

11、種另外, 。正因如此, 被國際同行專家譽為分子生物技術(shù)領(lǐng)域的一場革命。之后, 包括S tewart 研究小組在內(nèi)的多個實驗室又相繼和Red 蛋白組合也具有與RecE 發(fā)現(xiàn)噬菌體的Red RecT 類似的同源重組功能9-12。值得一提的是, 無論是RecE 所介導的同源重組, 只有在recBC D 2的大RecT 還是Red Red 腸桿菌中才能充分發(fā)揮作用。其原因是recBC D 作為大腸桿菌內(nèi)非常強效的核酸外切酶, 能夠快速降解外源線性DNA 分子, 包括PCR 產(chǎn)物和寡核苷酸13。在應(yīng)用RecE RecT 和實施同源重組時將recBC D 的主要抑制分子Red Red 進行共表達, 可使同

12、源重組在噬菌體的G am 蛋白(RedrecBC D 的大腸桿菌中同樣發(fā)揮作用。不同的實驗室對+1Red ET , 它是生物體用于糾正自身(DNA 復制過程中產(chǎn)生 或由外界因 素誘導所致DNA 突變的一種內(nèi)在機制, 由體內(nèi)的同源重組酶介導完成。同源重組酶的作用機理不同于限制性內(nèi)切酶, 它不受酶切位點限制, 只要供體和受體DNA 分子間具有一段相同的堿基序列(即所謂的同源臂 兩者就能發(fā)生重組或替換(圖1 。所介導同源重組的命名也各不相RecE RecT 和Red Red 同。除了上述的ET 克隆外, 還有ET 和GET 重組(GET14重組(recombination 11、recombinat

13、ion 、重組遺傳工程(Recombinogenic engineering 15以及重組工程(Recombineer 216所介導的同源重組ing 等。因為RecE RecT 和Red Red圖1同源重組示意圖Fig. 1The sketch map of hom olog ous recombination H A :hom ology arm A ; H B :hom ology arm B.可以相互通用, 為了統(tǒng)一概念, 最近S tewart 將它們統(tǒng)稱為Red ET 重組(Red ET recombination 。在這里Red 是指噬菌 ,ET 則代表了Rac 噬菌體的Red 蛋白

14、組合(Red Red Red17體的RecE RecT 。同源重組酶有多種, 不同的酶在進行同源重組時所需同源臂大小也不同, 其中最為人們熟知的是大腸桿菌RecA 系統(tǒng)。應(yīng)用RecA 介導的同源重組, 人們已經(jīng)實現(xiàn)了多種形式的DNA 修飾4, 5。近些年, 有研究者又利用該系統(tǒng)對載有基因組DNA 的BACs 和PACs 進行了成功修飾, 為基因敲除、轉(zhuǎn)基因等研究中上游靶分子的構(gòu)建提供了一條有效途徑6, 7。然而, 由RecA 介導的同源重組所需同源臂長度通常在1kb 左右, 這樣長的同源臂要加載到供體打靶分子的兩側(cè)并不容易, 而且同源重組過程一般要經(jīng)過重組(Recombination 和拆分(

15、Res olution 兩輪篩選, 操作相對費時、費力, 從而使其應(yīng)用受到很大程度的限制。1998年S tewart 研究小組報道了另一種可在大腸桿菌中2Red ET 重組的作用機理及其應(yīng)用方式事實上, 在Red ET 重組出現(xiàn)之前人們對RecE 、RecT 、和Red 這四種蛋白質(zhì)就有研究, 只不過所關(guān)注的是它Red們與DNA 雙鏈斷裂修復(D ouble strand break repair , DS BR 的實際上都具有典型的5關(guān)系。研究揭示RecE 和Red 3核酸外切酶活性, 它們能夠由5末端向3末端酶切雙鏈DNA(包括PCR 產(chǎn)物 , 使DNA 分子的3末端變成單鏈懸突(318,

16、 19, 體外結(jié)合實驗和ssDNA overhang 。對于RecT 和Red電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)它們其實是一種具有退火(Annealing 和鏈侵入(S trand invasion 功能的單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)20, 21。為此, 人們推測Red ET 重組的作用機理可能是:帶有同源臂的作用而使其兩端形成單供體DNA 分子首先經(jīng)RecE 或Red的引導下, 供體分子的同源臂鏈懸突, 然后在RecT 或Red單鏈懸突即可與受體分子的同源臂部分發(fā)生結(jié)合, 最終導致供體與受體DNA 分子發(fā)生重組和替換22(圖2 。應(yīng)用的同源重組技術(shù), 它是通過誘導表達Rac 噬菌體的RecE 和RecT 蛋白組合來介導實

17、施重組反應(yīng), 當時將這種技術(shù)命名為ET 克隆(ET cloning 8。與RecA 介導同源重組不同的是ET 克隆所需同源臂僅為3550bp , 且同源重組效率更高。3550bp 的同源臂意義非同尋常, 人們就可以通過 504Chinese Journal o f Biotechnology 生物工程學報2005,V ol 121,N o 13并且這種修復效率的高低與所選用核苷酸鏈的性質(zhì)有關(guān), 應(yīng)用與受體DNA 分子滯后鏈(Lagging strand 互補的寡核苷酸效果更好。由于寡核苷酸可以體外快速合成, 所以寡核苷酸修復的成功應(yīng)用使Red ET 重組更加引起人們的重視。Red ET 重組最

18、初所使用的依托質(zhì)粒是C olE1來源的和pBAD 2ET g 和pBAD 2gba , 在這兩個質(zhì)粒中RecE RecT Red 被置于P BAD , 同源重組酶的表達Red Red Red 受L 2阿拉伯多糖誘導調(diào)控, 9, , 25。在以后的應(yīng)用中人們逐漸發(fā)現(xiàn), , 。為此, 最近我們對Red ET 的依托, 構(gòu)建了低拷貝、溫度敏感型pSC1012BAD 2gbaA 質(zhì)粒。這種pSC101來源的質(zhì)粒在每個細胞中拷貝數(shù)為圖2Fig. 2The of recombination35個, 于30復制,37以上復制終止。在實驗過程中通過簡單、合理的改變宿主菌培養(yǎng)溫度, 就可使此依托質(zhì)粒在行使完Re

19、d ET 重組功能后自動地從宿主細胞中消失。這樣就容易獲得比較純的修飾后重組體。除了對依托質(zhì)粒的類型進行優(yōu)化外, 我們還將RecA 引進了Red ET 重組系統(tǒng)。之所以引入RecA 是因為常用工程菌都是RecA 缺失突變的大腸桿菌,RecA 缺失突變的目的是使外源質(zhì)粒DNA 尤其是BAC 復制穩(wěn)定。但RecA 的缺失也會帶來其它影響, 研究表Red ET :一是構(gòu)建含和Red 的誘導表達型依托質(zhì)有RecE RecT Red Red Red 粒, 通過共轉(zhuǎn)染使依托質(zhì)粒與受體和供體DNA 分子進入同一細胞內(nèi), 經(jīng)誘導表達后即可發(fā)生重組反應(yīng)+8, 9, 23。另外一種方式是篩選和構(gòu)建具有Red ET

20、 重組功能的大腸桿菌菌株, 如Zhang 等通過對sbcA (RecE RecT 大腸桿菌JC8679染色體上某些限制調(diào)節(jié)元件及內(nèi)源性Lac 操縱子進行突變?nèi)笔? 獲得了一株重組功能型工程菌Y Z 20009; Y u 等則是將突變失活的噬菌體整合到大腸桿菌的染色體中而構(gòu)建了具有同源重組功能的DY 330、DY 380等菌株10, 24明當RecA 缺失時大腸桿菌接受外源DNA 轉(zhuǎn)化的效率將會顯著降低27。為此, 在新的依托質(zhì)粒中我們將RecA 與一起置于P BAD 啟動子之后, 使其與Red 同源Red Red Red 重組酶共同表達。實驗結(jié)果證實,RecA 的瞬時表達可以通過促進外源DNA

21、 的轉(zhuǎn)化而顯著提高Red ET 的同源重組效率, 使得低拷貝型的依托質(zhì)粒具有高效的同源重組功能。此外, 人們對Red ET 重組介導非抗性基因打靶修飾時所使用的反向篩選系統(tǒng)也進行了多次改進。在嘗試了SacB 2Neo8, 23。這兩種使用方式各有利弊:由于依托質(zhì)粒的拷貝數(shù)要顯著高于染色體的單一拷貝, 所以前者提供重組酶蛋白的表達量和重組效率顯著高于后者25; 除了重組效率, 應(yīng)用依托質(zhì)粒在BACs 、PACs 或細菌染色體的修飾方面具有優(yōu)勢, 因為依托質(zhì)?？珊蚑 etR 28后,Jamsai 等29通過合理應(yīng)用限制性內(nèi)切以隨意轉(zhuǎn)化宿主菌; 但是, 當受體DNA 結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定, 能夠進行反復轉(zhuǎn)化

22、時, 應(yīng)用第二種方式相對簡單、省時24酶2Sce 顯著提高了反向篩選系統(tǒng)的嚴密性; 我們則是選用了只有114kb 的rps L 2Neo 作為反向正向篩選標記基因, 一方面便于PCR 擴增以加載同源臂, 另一方面又可采用卡那霉素和鏈霉素進行正、反向篩選, 從而使Red ET 重組的操作過程更加簡單、易行17。; 另外,應(yīng)用依托質(zhì)粒時要涉及到重組結(jié)束后依托質(zhì)粒的清除問題。3Red ET 重組的發(fā)展與改進Red ET 重組技術(shù)的建立, 讓人們實現(xiàn)了以PCR 產(chǎn)物作為供體分子對目的基因的打靶修飾。雖然這已經(jīng)使同源重組的操作和應(yīng)用向前邁出了歷史性的一步, 但是在某些情況下并不需要以PCR 產(chǎn)物作為供體

23、分子, 所需的是僅僅包含兩個同源臂的寡核苷酸短鏈, 如點突變或蛋白標簽的插入等。為此,Red ET 重組建立后不久, 人們即開始嘗試應(yīng)用體外直接合成的寡核苷酸來實施對目標DNA 分子的修飾。令人驚喜的是, 研究發(fā)現(xiàn)70100bp 長(兩側(cè)各帶3550bp 同源臂 的雙鏈和單鏈寡核苷酸, 同樣可以作為打靶分子來對BAC 進行點突變和插入等修飾Zhang 等1725, 264Red ET 重組在生物醫(yī)學中的應(yīng)用由于Red ET 重組在DNA 修飾方面具有常規(guī)分子克隆技術(shù)無法比擬的優(yōu)越性, 通過選擇同源臂的位置以及改變兩個同源臂之間的打靶序列, 人們可以達到對DNA 靶分子進行插入、融合、剪切、敲除

24、和突變等多種目的(圖3 , 所以該技術(shù)在生物醫(yī)學領(lǐng)域里具有廣闊的應(yīng)用前景和很高的實用價值。目前,Red ET 重組在生物醫(yī)學領(lǐng)域里應(yīng)用最廣泛的還是對載有基因組DNA 的BACs 、PACs 進行修飾, 為基因功能和表達研究提供有效的前期操作平臺。在具體應(yīng)用過程中, 當目的BACs 或PACs 僅需要刪除某部分基因序列時, 就可以通過Red ET 重組介導帶有同源臂的抗性標記基因插入并替?？紤]到RecE 和Red對單鏈寡核苷酸可能不起作用, 所以在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上的依托質(zhì)粒, 發(fā)現(xiàn)又構(gòu)建了只表達RecT 和Red應(yīng)用這種質(zhì)粒進行單鏈寡核苷酸修復時也具有很高的效率, 王軍平等:RedET 重組及其

25、在生物醫(yī)學中的應(yīng)用505導實施大腸桿菌染色體的各種遺傳修飾。與常規(guī)轉(zhuǎn)座子法相比,Red ET 重組介導的染色體修飾不僅高效、快速, 而且還能準確定位。應(yīng)用這種重組技術(shù)人們對大腸桿菌染色體上的多個基因如arcB 、cyaA 、recA 、ptsG 等進行了敲除、替換等修飾, 有目的地改良了一些生物工程菌株11, 30。除了工程菌外, 一些致病大腸桿菌的遺傳修飾也在引起人們的重視, 如Murphy 等31就通過該技術(shù)病大腸桿菌EHEC 和圖3Red ET 重組在DNA 工程中的應(yīng)用范例Fig. 3The applications of Red ET recombination in DNA eng

26、ineeringEPEC , 為制備腸道感染病疫。不僅如此, 借助合適此外, 隨著多種生物基因組DNA BAC 文庫的構(gòu)建和測序工作的實施與完成, 人們應(yīng)用Red ET 重組還可對病毒、噬菌體以及其它模式生物的基因組DNA 進行有目的修飾33, 從而加速生物體的基因功能研究。正是由于Red ET 重組在DNA 修飾方面的獨特優(yōu)勢, 基于該技術(shù)的DNA 工程操作已經(jīng)開始向生物制藥領(lǐng)域拓展, 尤其對于那些通過常規(guī)分子克隆很難實現(xiàn)的生物工程藥物的研制。如運用這種重組技術(shù)對載有聚酮合成酶基因簇的柯氏質(zhì)粒進行重排、突變、替換等修飾, 從而去創(chuàng)造生成新的抗生素34。最近, Eustaquio 等35就利用

27、此方法在對新生霉素基因簇進行替換修飾后獲得了一種新的“雜合抗生素”。換目的基因序列, 這種BACs 或PACs 的一步法修飾在一周內(nèi)即可完成23, 24。當需要在目的BACs 或PACs 一非篩選性基因(如LacZ 、EG FP 酸序列(如點突變、 時, 力, Red ET 重組才能達到修飾目的17, 25, , 29(圖4 。5結(jié)語總之, 作為生物工程領(lǐng)域里的一項革新性技術(shù),Red ET 重組能夠準確、快速地對目標DNA 分子, 尤其是基因組DNA 大分子進行各種人為修飾, 它的出現(xiàn)使以往通過傳統(tǒng)分子克圖4應(yīng)用Red ET 重組介導BAC 修飾的操作示意圖Fig. 4The sketch m

28、ap of BAC m odification mediatedby Red ET recombinationcsm :counter 2selectable marker ; sm :selectable marker ; H A :hom ology arm A ;H B :hom ology arm B ; Cm :chloram phenicol.隆技術(shù)無法完成的多種DNA 操作得以實現(xiàn)。隨著后基因組時代的到來,Red ET 重組的發(fā)展和應(yīng)用將會顯著推動基因組功能的研究進展。REFERENCES (參考文獻1Bogue CW. G enetic m odels in applied p

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30、i using an F 2factor 2based vector. Proc Natl Acad Sci USA , 1992,在對BACs 或PACs 修飾的基礎(chǔ)上, 運用Red ET 重組還可以進行基因敲除動物上游靶分子的快速構(gòu)建?；緦嵤┓桨赣袃煞N, 其一是首先應(yīng)用Red ET 重組從目標BAC 或PAC 上亞克隆目的基因序列(含左右長短臂 至打靶質(zhì)粒載體中, 然后再應(yīng)用Red ET 重組將帶有原核與真核雙啟動子的p GK neo 定點插入并刪除目的基因序列; 另外一種實施方式是, 首先對目標BAC 或PAC 進行修飾, 即將帶有原核與真核雙啟動子的p GK neo 定點插入并刪除目

31、的基因序列, 然后再通過Red ET 重組進行亞克隆。兩種方案都是僅需兩次簡單的Red ET 重組即能完成基因敲除靶分子的構(gòu)建。同理, 對于條件性敲除DNA 靶分子的構(gòu)建則需再多進行一步Red ET 重組和Cre 重組過程。與傳統(tǒng)PCR 擴增和酶切連接法相89(18 :8794-87973Zhao S. A com prehensive BAC res ource. Nucleic Acid Res , 2001, 29(1 :141-1434O C onnor M , Peifer M , Bender W. C onstruction of large DNA seg 2ments in

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33、用是介5066Y ang XW , M odel P , Heintz N. H om olog ous recombination based on m odification in E scherichia coli and germline transmission in trans 2genic mice of a bacterial artificial chrom os ome. Nat Biotech , 1997, 15(9 :859-8657G ong S , Y ang XW ,Li C et al . H ighly efficient m odification of

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