Fe3O4-葡聚糖-抗體磁性納米生物探針的制備和層析檢測

1、Vol.252004年3月高等學?；瘜W學報CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIESNo.3445 447研究快報IF 304/葡聚糖/抗體磁性納米生物探針的制備和層析檢測洪霞.郭薇.李軍.劉艷梅.楊文勝.白玉白.李鐵津袁航.馬嵐(吉林大學化學學院.長春130023D(云南大學單克隆抗體工程技術(shù)研究中心.昆明650091D磁性生物探針;抗原 抗體識別;BSA封閉;層析檢測中圖分類號O657文獻標識碼A文章編號關(guān)鍵詞0251 0790(2004D03 0445 03在免疫檢測中.經(jīng)常利用一些具有特殊物理化學性質(zhì)的標記物對抗體(或抗原D進行偶聯(lián)標記.在抗體與抗原識別后

2、.通過對標記物的定性和定量檢測而達到對抗原(或抗體D檢測的目的.傳統(tǒng)的免疫標記物包括放射性同位素1I酶2I膠體金3I和有機熒光染料分子4I等.近年來.隨著納米技術(shù)的發(fā)展.半導體熒光納米晶5.6I和磁性納米晶7I在免疫檢測方面受到了廣泛關(guān)注.磁性納米晶性能穩(wěn)定.較易制備.可與多種分子復合使粒子表面功能化.并且由于磁納米晶具有超順磁性.為樣品的分離富集和提純提供了很大方便.這些優(yōu)點使它逐漸成為新一代的標記物而廣泛應用于生物化學分子生物學和臨床醫(yī)學等多個領域.如生物學分離8I細胞標記9I藥物傳送10I和磁性造影劑11I等方面.為了達到層析免疫檢測的目的.選用葡聚糖包覆超順磁性的Fe3O4納米粒子.通

3、過葡聚糖表面的醛基化實現(xiàn)與抗體的偶聯(lián).制得了Fe3O4/葡聚糖/抗體磁性納米生物探針.并用此探針在組裝有第二抗體和抗抗體的全層析試紙上進行了層析實驗.結(jié)果表明.該探針完全適用于快速免疫檢測的需要.1實驗部分1.1試劑與儀器葡聚糖(DextranD購自PharmaciaBiotech公司(分子量為40000D.鼠源單克隆乙肝病毒表面抗原抗體(簡稱anti HBSAg.分子量為160000D由云南大學單克隆抗體工程技術(shù)研究中心提供.牛血清白蛋白(BSA.由607個氨基酸組成.分子量為66000D為Sigma公司產(chǎn)品.實驗用水均-1為Milli O高純水(18.3MO-cmD.AutoProbeCP

4、型掃描探針顯微鏡(SPMD為ParkScientificInStrument公司產(chǎn)品.采用非接觸掃描模式.1.2Dextran Fe3O4復合物的制備及其醛基化參照文獻12I方法.在四頸瓶中加入2.5g葡聚糖.0.276gFeCl2-4H2O和0.225gFeCl3-6H2O.然后加入5mL高純水.通氮氣攪拌至溶.并混合均勻.在60 和N2氣氛圍中恒溫15min.滴加5mL氨水.反應15min后用乙酸調(diào)節(jié)pH約為7.以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min.用磁性分離柱進一步提純上清液.最后用10mL乙酸鈉溶液(pH=6.5D洗脫.向所得洗脫液中加入NaIO4溶液.至反應液中NaIO4濃度為5

5、mmol/L.于暗態(tài)N2氣氛圍下反應5h.用磁性分離柱分離提純.得到醛基化產(chǎn)物.產(chǎn)率為80%.根據(jù)XRD和TEM測試結(jié)果.12IFe3O4納米晶的尺寸為8nm.1.3磁性納米復合物與anti HBSAg的生物偶聯(lián)取1mL醛基化的dextran Fe3O4.加入6pLanti HBSAg.混合均勻后.于4 下反應24h.然后加入100pL質(zhì)量分數(shù)為10%的BSA溶液進行封閉.收稿日期:2003 09 16.基金項目:國家自然基金項目(批準號:20073016.60271020D國家973'計劃項目(批準號:G1999064504D和863'計劃項目(批準號:2002AA30220

6、3D資助.聯(lián)系人簡介:白玉白(1941年出生D.男.教授.博士生導師.從事凝聚態(tài)光物理與光化學研究.E mail:yubai振蕩均勻后在4 下反應24h.再加入O.5mOl/LNaBH4于上述體系中,攪拌均勻,于4 反應3h.于4 ,以13OOOr/min的轉(zhuǎn)速離心2Omin,用NaB03(PH=8.5D緩沖溶液洗滌3次.最后用1mLNaB03(PH=8.5D的緩沖溶液重新分散,于4 下保存.2結(jié)果與討論2.1Fe304/葡聚糖/抗體磁性納米生物探針的制備圖1為制備生物探針的原理圖.葡聚糖與FeCl2和FeCl3在堿性條件下共沉淀,生成Fe304/葡聚糖納米復合物,葡聚糖表面帶有大量羥基;經(jīng)N

7、aI04氧化后,葡聚糖表面的羥基轉(zhuǎn)化為醛基;通過S hi 堿反應,可實現(xiàn)與anti-HBSAg的耦聯(lián);用NaBH4進行還原,有利于得到更穩(wěn)定的產(chǎn)物;最后,表面剩余的空位用BSA進行封閉.用BSA包覆的Fe304/葡聚糖/anti-HBSAg構(gòu)成了磁性納米生物探針.446高等學?；瘜W學報VOl.25Fig.1Schematicofmechanismofanti-Hbsagimmobilizedondextran-coatedmagneticnanocomposites利用SPM的AFM功能對BSA封閉的Fe304/葡聚糖/anti-HBSAg探針進行了表面形貌觀察(圖2D.由圖2可見,該探針為分

8、散較好,在直徑為75nm的球體表面吸附了許多直徑大約為12nm的小亮球,它對應于anti-HBSAg,與文獻13結(jié)果一致.Fig.2MorphologicimageofFe3O4/dextran/anti-2Hbsagcomplexeswithscanningarea0.5pmFig.3Schemeofimmunochromatography2.2免疫層析快速檢測技術(shù)免疫層析技術(shù)是近年來新興的一種快速診斷技術(shù),其原理如圖3所示.免疫層析試紙條由硝酸纖維素膜制成,在紙條的下端是載有Fe304/葡聚糖/anti-HBSAg探針的探針帶,其中anti-HBSAg為識別待測樣品中的對應抗原.在樣品帶的

9、某一確定位置組裝了第二抗體作為測試帶,它專門識別待測樣品中抗原的第二位點.在測試帶上方某一位置固定有抗抗體作為控制帶,以便截斷沒有抓住抗原的探針運行.檢測時,將探針帶浸入到含有待測抗原的溶液中,待測抗原與探針帶中的抗體通過毛細作用使探針與識別的抗原一起沿免疫試紙條向上移動,當移動至測試帶時,第二抗體會識別抗原的另一活性位而被截住,使該區(qū)域顯示標記物的顏色.對于沒有抓住抗原的探針,將繼續(xù)前進至控制帶,探針抗體與抗抗體結(jié)合,也顯示標記物的顏色.如果控制帶無顏色,則說明探針已經(jīng)失效.這就是一次完整的免疫特異性檢測.圖4是利用BSA包覆的Fe304/葡聚糖/anti-HBSAg生物探針所作的層析實驗.

10、由于待測樣品是No. 洪霞等 Fe 0 /葡聚糖/抗體磁性納米生物探針和層析檢測水 所以僅在控制帶區(qū)域(箭頭A所指方向)出現(xiàn)一條整齊的淺褐色帶(Fe 0 的顏色) 而在測試帶(箭頭B所指方向)和紙條其它表面完全沒有探針遺留的痕跡 表明Fe 0 /葡聚糖/anti-BsAg生物探針保持有較高的反應活性.同時還表明BSA的封閉是非常完全的 并未發(fā)生任何非特異性吸附.我們還利用酶聯(lián)檢測技術(shù)(ELISA)對這種生物探針進行活性檢測結(jié)果表明 anti-BsAg仍保持較高的反應活性 與層析實驗的結(jié)果相吻合.3結(jié)論成功地制備了BSA包覆的Fe 0 /葡聚糖/anti-BsAg磁性納米生物探針 在組裝有測試帶

11、和控制帶的免疫層析試紙上進行的層析實驗表明 該探針與控制帶上的抗抗體發(fā)生作用 說明探針始終保持較高的抗體活性;探針與測試帶未fig.4Photographyofimmunochromatographicstrip 發(fā)生識別 說明BSA封閉效果良好 避免了非特異性相互作A Controlline;B testline.用.這為進一步的臨床實驗奠定了基礎.如果有高靈敏的磁測儀 完全可以得到定量檢測結(jié)果.參考文獻 KimM.S. AhnS.M. MoonA.ArchivesPharm.ResearchJ DuanC. MeyerhoffM.E.Anal.Chem.J NiJ. LipertR.J.

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14、ntibodyandChromatographicAssay%0NGXia GU0Wei LIJun LIUYan-Mei YANGWen-Sheng BAIYu-bai LITie-Jin(CollegeofC Jlll7U7l C C e?lSt7e7Slta7gl /7 l7a)YUANang MALan(Mo7ollo7alA7tlbocTel K/7?l7g C 7ologCe7te7 Y/77a7U7l e7Sltl7a)AbstractDeXtran-coatedmagneticnanocompositeswereprepared.AperiodateoXidationmethodwasusedtofurtheractivatethemagneticdeXtran formingmagneticpolyaldehyde-deXtran whichcouldbeconjugatedtobiomolecules antibodes.Thema