半胱氨酰白三烯受體拮抗劑對氣道結構細胞內(nèi)皮素1表達的影響

1、半胱氨酰白三烯受體拮抗劑對氣道結構細胞內(nèi)皮素1表達的影響【摘要】目的探討半胱氨酰白三烯(CysLTs)受體拮抗劑(扎魯司特)對白三烯C4(LTC4)刺激人氣道結構細胞內(nèi)皮素1(ET-1)基因表達及分泌的影響。方法在離體培養(yǎng)人氣道上皮細胞株(16-HBE)和氣道平滑肌細胞 (ASMC)培養(yǎng)液中加入扎魯司特，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測培養(yǎng)液ET-1水平；用逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測ET-1 mRNA表達量。結果扎魯司特可抑制LTC4 誘導16-HBE及ASMC ET-1 mRNA表達及ET-1釋放。16-HBE ET-1 mRNA由0.230.10降至0.100.03，E

2、T-1由(12.71.3) ng/L降至(5.52.6) ng/L，前、后比較差異有顯著性(t分別為3.698和4.693，P分別為0.034和0.019)；ASMC ET-1 mRNA由 0.130.04 降至0.040.02；ET-1由(7.51.0) ng/L降至(4.40.9) ng/L，前、后比較差異有顯著性(t分別為4.629和5.003，P分別為0.019和0.007)。結論扎魯司特能抑制LTC4誘導16-HBE及ASMC ET-1 mRNA表達及ET-1釋放，這可能是CysLTs受體拮抗劑抗氣道炎癥的機制之一。【關鍵詞】白三烯受體拮抗劑；氣道上皮細胞；氣道平滑肌細胞；內(nèi)皮素 Z

3、afirlukast inhibition of leukotriene C4 induced endothelin-1 expression in human airway structural CellCHEN Aihuan, ZHONG Nanshan.(Guangzhou Institute of Respiratory Disease，Guangzhou 510120, China)【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of a cysteinyl leukotriene receptor antagonist (zafirluk

4、ast) on endothelin-1(ET-1) expression in human airway epithelial cell line (16-HBE) and airway smooth muscle cells (ASMC) in response to leukotriene C4 (LTC4) stimulation. Methods16-HBE or ASMC was incubated with 10-8 mol/L LTC4 and graded concentrations of zafirlukast. ET-1 level in supernatant was

5、 determined by ELISA and ET-1 mRNA expression was assessed by RT-PCR. Results(1) LTC4 induced ET-1 mRNA expression in 16-HBE and ASMC was significantly inhibited by zafirlukast (10-8 mol/L ) 0.230.10 vs. 0.100.03 (16-HBE), t=3.698, P=0.034; 0.130.04 vs. 0.040.02 ASMC, t=4.629, P=0.019. (2) When grad

6、ed concentrations of zafirlukast (0, 10-12 mol/L, 10-10 mol/L, 10-8 mol/L, 10-6 mol/L ) were added to the LTC4 cultured 16-HBE and ASMC, a significant inhibition of ET-1 production was observed in both groups cultured with 10-8 mol/L or more zafirlukast (12.71.3) ng/L vs (5.52.6) ng/L 16-HBE, t=4.69

7、3, P=0.019；(7.51.0) ng/L vs (4.40.9) ng/L ASMC (t=5.003, P=0.007). (3) There was a significant negative linear correlation between ET-1 levels and zafirlukast concentrations in LTC4-treated 16-HBE and ASMC (16-HBE: r=-0.9177, P=0.0289; ASMC: r=-0.9451, P=0.0153）. ConclusionsThese data suggest that z

8、afirlukast inhibis LTC4- induced ET-1 over-expression 16-HBE and ASMC, which may be one of the anti-inflammatory mechanism of LTs receptor antagonists.【Key word】Leukotriene receptor antagonist；Airway epithelial cell；Airway smooth muscle cell；Endothelin半胱氨酰白三烯( CysLTs)受體拮抗劑是近年來發(fā)展起來的新一代非類固醇類抗哮喘藥。研究證明，

9、CysLTs受體拮抗劑具有抗氣道炎癥作用1，但有關其抗氣道炎癥的機制尚未明了。近年發(fā)現(xiàn)，氣道結構細胞自分泌的內(nèi)皮素1(ET-1)是氣道收縮、炎癥與重建的重要介質(zhì)2，已知參與哮喘發(fā)病過程的眾多細胞因子是通過形成相互作用的網(wǎng)絡而發(fā)揮效應的，Patrigani等3報道CysLTs 能促進血管平滑肌細胞釋放ET-1。因此有理由推測CysLTs是否亦能促進氣道結構細胞釋放ET-1，而CysLTs受體拮抗劑可能對抗CysLTs 的此種效應，從而產(chǎn)生抗氣道炎癥作用，我們的研究通過觀察 CysLTs受體拮抗劑(扎魯司特)對白三烯C4(LTC4)刺激人氣道上皮細胞和平滑肌細胞 ET-1基因表達及分泌的影響，探討

10、CysLTs受體拮抗劑抗氣道炎癥的機制。材料與方法一、材料1.正常人氣道上皮細胞株(16-HBE)由英國Southampton大學惠贈。2.扎魯司特(zafirlukast)由英國Zeneca公司惠贈。3.MEM培養(yǎng)液：含10%胎牛血清，200 U/ml 青霉素，200 U/ml 鏈霉素。4.F12培養(yǎng)液：含10%胎牛血清，200 U/ml 青霉素，200 U/ml鏈霉素。5.平滑肌細胞消化液：含640 U/ml 膠原酶，1 mg/ml豆胰蛋白酶，10 U/ml彈性蛋白酶， 0.2 mmol/L氯化鈣。二、方法1.LTC4對人氣道結構細胞ET-1 mRNA表達及ET-1分泌水平的作用： 取第3

11、5代16-HBE細胞，以每孔1105 ml接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當細胞長滿85%90% 瓶底時用于實驗。實驗共分5組，每組4孔。對照組（ELT 0組）：只加MEM空白培養(yǎng)液及ELT 14組，分別加入10-12 mol/L、10-10 mol/L、10-8moL/l、10-6 mol/L LTC4后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞培養(yǎng)液，密封保存于-80 低溫冰箱中待測ET-1。收集 ELT 0組及ELT 3組(預試驗證明該濃度刺激ET-1分泌作用最強)細胞提取總RNA，待進行逆轉錄多聚酶鏈式反應(RT-PCR)。 取肺移植供體支氣管肺組織，參照文獻4的方法，用3 ml平滑肌消化液室溫下消化分離氣道

12、平滑肌細胞(ASMC)，用F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細胞長至基本融合狀態(tài)后用0.25% 胰蛋白酶消化傳代。取第35代ASMC，以每孔1105 ml接種于6孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)至細胞長滿85%90% 瓶底時用于實驗。實驗共分5組，每組4孔。對照組（SLT 0組）：只加 F12空白培養(yǎng)液及SLT 14組， 各組分別加入10-12 mol/L、10-10 mol/L、10-8 mol/L、10-6 mol/L LTC4后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞培養(yǎng)液待測ET-1。收集SLT 0組及SLT 3組細胞提取總RNA，待進行RT-PCR。2.扎魯司特對LTC4刺激氣道結構細胞ET-1 mRNA表達及ET-1分泌的

13、影響：將16-HBE及ASMC(來源同上)均分為5組(16-HBE：ELZ 04組)，每組4孔，每組加入相同濃度的LTC4 (10-8 mol/L)， 但加入不同濃度扎魯司特，其濃度分別為0、10-12 mol/L、10-10 mol/L、10-8 mol/L、10-6 mol/L。加LTC4和扎魯司特后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞培養(yǎng)液待進行ET-1水平測定。收集扎魯司特濃度為0(SLZ 0組)及10-8 mol/L(SLZ 3組)2孔細胞提取總RNA，待進行RT-PCR。3.ET-1水平測定：用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定ET-1(美國R&D公司)水平。4.RT-PCR測定ET-1基因表

14、達水平4：采用異硫氰酸胍一步法提取細胞總RNA。采用美國Promega公司逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA，然后通過PCR擴增ET-1 cDNA和-actin cDNA。ET-1引物序列：上游：5AACCATGGATTATTTGTCCATG3，下游：5AGTGTTGACCCAAATGATGTC3，此對引物擴增出一條230 bp的ET-1 cDNA片段。-actin引物序列：上游：5ATCTGACACCACACCTTCTACAATGAGC TGCG3，下游：5CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCAC ATCTG 3，此對引物可擴增出一條838 bp的-actin cDNA片段。PCR反

15、應條件為：94 變性1 min， 59 退火1 min，72 延伸 1 min，共進行35個循環(huán)，72 加強延伸7 min。統(tǒng)計學處理：采用Origin 4.1統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以s表示，組間采用兩個樣本均數(shù)t檢驗來比較。結果一、LTC4對16-HBE及ASMC ET-1mRNA表達及ET-1分泌的影響LTC4可刺激16-HBE及ASMC分泌ET-1，當LTC4濃度10-8 mol/L時，兩種細胞ET-1分泌水平均顯著高于對照組(P均0.05，1)。 LTC4可使兩種細胞ET-1mRNA表達水平顯著上調(diào)，16-HBE由0.190.15上調(diào)至0.430.2（t=7.160，P=0.005)；ASMC

16、由0.380.14上調(diào)至0.540.14（t=4.833，P=0.017)。二、扎魯司特對LTC4誘導16-HBE及ASMC ET-1 mRNA表達及ET-1分泌的影響扎魯司特可抑制LTC4誘導16-HBE及ASMC釋放ET-1，當扎魯司特濃度10-8 mol/L時，兩種細胞ET-1分泌水平明顯低于對照組16-HBE：(12.71.3) ng/L降至(5.52.6) ng/L，t=4.693，P=0.019；ASMC：(7.51.0) ng/L降至(4.40.9) ng/L，t=5.003，P=0.007，表 1。扎魯司特對LTC4誘導16-HBE及ASMC分泌ET-1的劑量-效應關系均呈顯著

17、直線負相關(16-HBE：r=-0.9177，P=0.0289；ASMC：r=-0.9451，P=0.0153)。扎魯司特可明顯抑制LTC4誘導16-HBE及ASMC ET-1mRNA表達，16-HBE ET-1 mRNA由0.230.10降至0.100.03（t=3.698，P=0.034)；ASMC ET-1 mRNA由0.130.04降至0.040.02（t=4.629，P=0.019)。1LTC4對人氣道上皮細胞及平滑肌細胞ET-1分泌水平的影響表1 扎魯司特對LTC4刺激人氣道上皮細胞及平滑肌細胞ET-1分泌水平的影響(s)組別標本數(shù)ET-1濃度（ng/L）上皮細胞平滑肌細胞LZ0組

18、412.71.37.51.0 LZ1組411.61.66.91.4LZ2組4 11.11.86.81.4LZ3組49.61.6*4.81.7*LZ4組45.52.6*4.40.9*注：LZ04組LTC4 濃度均為10-8 mol/L，而扎魯司特濃度分別為0、10-12、10-10、10-8、10-6 mol/L；與對照組(LZ0)比較*P0.05，*P0.01 討論白三烯（LTs）是花生四烯酸經(jīng)5-脂氧酶（5-LO）代謝途徑形成的代謝產(chǎn)物，包括二羥酸白三烯(LTB4)及半胱氨酰白三烯(包括LTC4 、LTD4 、LTE4)。LTs的主要生物學活性3包括：（1）引起氣道平滑肌收縮；（2）增加血管

19、通透性；（3）增加粘液分泌；（4）促進嗜酸細胞（EOS）等炎癥細胞在氣道的聚集5；（5）促進氣道上皮細胞、氣道平滑肌細胞等增殖，從而參與氣道重塑6，7?？梢奓Ts在哮喘發(fā)生發(fā)展過程中的多個環(huán)節(jié)都起作用。但CysLTs配基與受體作用方式存在種屬差異，如豚鼠的氣道中存在CysLT1和CysLT2受體，LTD4和LTE4作用于CysLT1受體，LTC4作用于CysLT2受體。而人的氣道中僅存在CysLT1受體，LTC4、LTD4和LTE4均作用于CysLT1受體8，9。研究表明，LTC4和LTD4可促進巨噬細胞合成血小板衍生生長因子及血栓素10，11。 Patrigani等3亦報道，LTC4 能使血

20、管平滑肌細胞ET-1釋放增加。本組研究結果顯示，LTC4能使離體培養(yǎng)的人氣道上皮細胞及平滑肌細胞 ET-1分泌增加，而此種增加與ET-1mRNA的表達上調(diào)有關。目前亦有研究提示，CysLTs受體拮抗劑具有消除氣道炎癥的作用。 Calhoun等1報道，輕度哮喘患者吸入抗原可使支氣管肺泡灌洗液（BALF）中EOS、淋巴細胞、嗜堿細胞等炎癥細胞計數(shù)增加，口服扎魯司特 20 mg/d 1周后，再吸入抗原其BALF中上述細胞計數(shù)較安慰劑組明顯減少。Kemp等12報道，扎魯司特可明顯抑制哮喘患者吸入抗原后BALF中TNF-a水平的升高。本組結果亦顯示，扎魯司特可使 LTC4刺激人氣道上皮細胞及平滑肌細胞E

21、T-1 mRNA的表達下調(diào)及ET-1的分泌減少，且其抑制作用與扎魯司特的濃度呈高度直線相關。如前所述，氣道結構細胞自分泌的ET-1是氣道收縮、炎癥及重建的重要介質(zhì)，CysLTs受體拮抗劑抑制多種細胞因子及炎癥介質(zhì)特別是ET-1的釋放可能是其抗氣道炎癥的重要機制?？拱兹┧幬餅橄姆乐翁峁┝擞忠恍碌耐緩?，并逐漸顯示出其臨床價值，1998年全球哮喘防治創(chuàng)議(GINA)已將其列為中、重度持續(xù)哮喘的預防用藥，但有關其在哮喘防治中的確切地位、長期效果及其抗氣道炎癥及重塑的其他機制尚有待進一步探討。作者單位：陳愛歡(510120 廣州呼吸疾病研究所)鐘南山(510120 廣州呼吸疾病研究所)參考文獻1.

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