惡性瘧原蟲頂端膜抗原1基因轉(zhuǎn)染伯氏瘧原蟲模型的建立

1、惡性瘧原蟲頂端膜抗原1基因轉(zhuǎn)染伯氏瘧原蟲模型的建立         07-08-23 14:21:00     編輯：studa20               作者：陳俊，繆軍，劉忠湘，李淑梅，薛采芳【關(guān)鍵詞】  伯氏瘧原蟲；惡性瘧原蟲；頂端膜抗原1；轉(zhuǎn)染   【Abstract】 AIM: To esta

2、blish the model of Plasmodium berghei (P. berghei) transfected with Plasmodium falciparum (P. falciparum) apical membrane antigen1 (AMA1) gene. METHODS: The transfection plasmid pDB.DTm.DB./AB.AF.DB. containing P.falciparum AMA1 was enzymed by BglI. Blood stages of P.berghei were cultured in vitro,

3、and mature schizonts were purified. Parasites transfected by electroporation were injected into tail veins of mice. Transfected parasites were selected by treating mice with pyrimethamine. DNA of transfected, resistant parasites was isolated and analyzed by PCR.RESULTS: The gene encoding P.falciparu

4、m AMA1 was amplified by PCR in the transfected parasites. CONCLUSION: The model of P.berghei transfected with P.falciparum AMA1 gene was established, which provided a basis for further study.   【Keywords】 Plasmodium berghei；Plasmodium falciparum；apical membrane antigen1；transfection &

5、#160; 【摘要】 目的： 建立惡性瘧原蟲頂端膜抗原1（AMA1）基因轉(zhuǎn)染伯氏瘧原蟲的模型. 方法： 將含有惡性瘧原蟲AMA1基因的重組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDB.DTm.DB./AB.AF.DB.用BglI酶切線性化. 伯氏瘧原蟲經(jīng)體外培養(yǎng)和分離后進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的原蟲經(jīng)藥物篩選后進(jìn)行PCR檢測. 結(jié)果： PCR檢測顯示轉(zhuǎn)染伯氏瘧原蟲存在惡性瘧原蟲AMA1基因.  結(jié)論： 成功建立了惡性瘧原蟲AMA1基因轉(zhuǎn)染伯氏瘧原蟲的模型,為進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ).   【關(guān)鍵詞】 伯氏瘧原蟲；惡性瘧原蟲；頂端膜抗原1；轉(zhuǎn)染     0引言

6、0;  瘧疾是世界上對人類危害最嚴(yán)重的傳染病之一. 目前藥物和疫苗對瘧疾，尤其是惡性瘧的防治效果均不理想. 對瘧原蟲生物學(xué)特性的深入研究可能為瘧疾防治提供新的思路. 瘧原蟲轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用，為進(jìn)一步研究瘧原蟲的生物學(xué)特性，特別是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能提供了有效的實(shí)驗(yàn)手段1. 頂端膜抗原1（AMA1）是瘧疾紅內(nèi)期疫苗的重要候選抗原. 在鼠瘧模型和猴瘧模型中，鼠和猴瘧原蟲AMA1可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的產(chǎn)生2-3. 我們建立了惡性瘧原蟲AMA1基因轉(zhuǎn)染伯氏瘧原蟲的模型,為更深入研究惡性瘧原蟲AMA1的功能及評價(jià)惡性瘧原蟲AMA1特異性抗體在體內(nèi)的保護(hù)性作用提供了新的工具.   1材

7、料和方法   11材料水平式離心機(jī)(北京醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品,型號LXJ6401)，電穿孔儀Nucleofector Device（Amaxa）. 伯氏瘧原蟲ANKA株由我室保存. 清潔級Wistar大鼠（200 g）和昆明小鼠(1820 g)由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供. 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDB.DTm.DB./AB.AF.DB.4含有伯氏瘧原蟲的二氫葉酸還原酶/胸腺嘧啶合成酶突變體基因（DHFR/TS），提供乙胺嘧啶抗性,由德國海德堡大學(xué)Bujard教授惠贈(zèng). 核酸內(nèi)切酶BglI（大連TaKaRa），凝膠回收試劑盒（上海華舜生物工程公司），胎牛血清(Gibco)，Nycodenz(

8、AxisShield)，乙胺嘧啶(Sigma)，Human T Cell Nucleofector Kit(Amaxa).   1.2方法   121轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的線性化重組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDB.DTm.DB./AB.AF.DB.用BglI酶切后，膠回收線性化片段，將濃度稀釋為1 g/L，-20保存?zhèn)溆?   122伯氏瘧原蟲的培養(yǎng)液氮中保種的伯氏瘧原蟲ANKA株經(jīng)腹腔接種昆明小鼠，待原蟲率達(dá)515，鼠尾靜脈取血, 以40 L/只腹腔接種Wistar大鼠. 45 d后，原蟲率達(dá)1%3，且大部分原蟲處于環(huán)狀體和早期滋養(yǎng)體時(shí)，心臟穿刺取血. 鼠血用

9、250 mL/L的胎牛血清洗滌1次，用水平式離心機(jī)以1500 r/min離心8 min. 洗滌后的細(xì)胞用250 mL/L的胎牛血清重懸后加入錐形瓶，并在瓶中注入含50 mL/L CO2, 50 mL/L O2和900 mL/L N2的混合氣體，將瓶口封嚴(yán)后置于37以30 r/min低速振搖培養(yǎng)22 h.     07-08-23 14:21:00     編輯：studa20   123成熟裂殖體的分離在Nycodenz細(xì)胞分離液上小心加入體外培養(yǎng)的原蟲，用水平式離心機(jī)以1500 r/min離心

10、30 min. 含有成熟裂殖體的紅細(xì)胞位于兩層懸浮液之間，呈棕色. 小心吸取棕色層的細(xì)胞，用250 mL/L的胎牛血清洗滌1次，以1500 r/min離心8 min.   124電穿孔轉(zhuǎn)化將原蟲按1×107重懸于100 L含10 g轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的“Human T cell Nucleofector Solution”緩沖液. 重懸后的液體加入電轉(zhuǎn)杯，用電穿孔儀Nucleofector Device進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化，程序設(shè)定為U33. 電轉(zhuǎn)化后迅速向電轉(zhuǎn)杯加入50 L細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行重懸.   125轉(zhuǎn)化原蟲的篩選將上述150 L重懸液經(jīng)尾靜脈注射昆明小

11、鼠. 24 h后將乙胺嘧啶按10 mg/kg腹腔注射感染轉(zhuǎn)化原蟲的昆明小鼠，每日注射1次，連續(xù)注射5 d. 鼠尾靜脈采血涂片觀察原蟲感染率.   126轉(zhuǎn)化原蟲的檢測待原蟲感染率1，將被感染小鼠摘除眼球取血，收集紅內(nèi)期原蟲，并抽取原蟲的基因組DNA，以其為模板進(jìn)行PCR檢測，選用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDB.DTm.DB./AB.AF.DB.及惡性瘧原蟲云南株基因組DNA作為陽性對照，未轉(zhuǎn)染的伯氏瘧原蟲ANKA株為陰性對照. 參照GenBank中已發(fā)表的惡性瘧原蟲AMA1胞外域的基因序列設(shè)計(jì)引物. 上游引物：5ATG ATT GAA ATA GTA GAA AGA AGT3；下游引物：5

12、TTA TTT CAT GTT ATC ATA AGT TGG3. 引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成. PCR反應(yīng)條件為：94預(yù)變性2 min；94 30 s，50 30 s，68 80 s，30個(gè)循環(huán)；68延伸5 min. PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行分析.   2結(jié)果   連續(xù)5 d藥物篩選后，鼠尾靜脈采血涂片顯示原蟲感染率達(dá)3. 轉(zhuǎn)化原蟲的基因組DNA和陽性對照組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后均獲得約1350 bp的條帶，與惡性瘧原蟲AMA1胞外域基因片斷長度相符，而未轉(zhuǎn)染的伯氏瘧原蟲基因組DNA未擴(kuò)增出條帶（圖1），證明目的基因已經(jīng)整

13、合入伯氏瘧原蟲的基因組.   3討論   瘧原蟲轉(zhuǎn)染技術(shù)是研究瘧原蟲蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重要方法. 將外源DNA導(dǎo)入寄生于紅細(xì)胞的瘧原蟲細(xì)胞核，必須經(jīng)過紅細(xì)胞膜、納蟲泡膜、瘧原蟲細(xì)胞膜和蟲體細(xì)胞核膜4層膜，實(shí)際進(jìn)入蟲體核內(nèi)的DNA可能很少. 所以，轉(zhuǎn)染效率對于瘧原蟲轉(zhuǎn)染的成敗十分關(guān)鍵. 對人原代細(xì)胞和干細(xì)胞等進(jìn)行轉(zhuǎn)染的研究表明，Amaxa的電穿孔儀Nucleofector Device具有較高的轉(zhuǎn)染效率5-7. 我們利用Nucleofector Device成功建立了伯氏瘧原蟲的轉(zhuǎn)染技術(shù)，為研究瘧原蟲的生物學(xué)特性奠定了技術(shù)基礎(chǔ).   1

14、：質(zhì)粒pDB.DTm.DB./AB.AF.DB.；2：惡性瘧原蟲基因組DNA；3：轉(zhuǎn)染伯氏瘧原蟲基因組DNA；4：未轉(zhuǎn)染伯氏瘧原蟲基因組DNA;M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).   圖1轉(zhuǎn)化原蟲的PCR檢測   AMA1是瘧疾紅內(nèi)期疫苗的重要的保護(hù)性抗原，用其純化的天然抗原或重組蛋白在小鼠和猴體模型中均誘導(dǎo)出對瘧原蟲攻擊的保護(hù)性免疫，自流行區(qū)人群分離的AMA1特異性抗體在體外可抑制惡性瘧原蟲裂殖子入侵紅細(xì)胞8. 由于惡性瘧原蟲專性寄生于人體，故實(shí)驗(yàn)室研究中缺乏惡性瘧原蟲的感染動(dòng)物模型，這給評價(jià)保護(hù)性抗體在體內(nèi)抑制惡性瘧原蟲的作用造成了極大障礙. 我們建立的惡性瘧原蟲AMA1基因轉(zhuǎn)染伯氏瘧原蟲模型，為評價(jià)惡性瘧原蟲AMA1特異性抗體的保護(hù)性作用提供了條件.   【參考文獻(xiàn)】   1 Waters AP, Thomas AW, van Dijk MR, et al. Transfection of malaria parasitesJ. Methods，1997，13(2):134-147.