淺論ppGalNAcT2反義RNA對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901生物學(xué)特性的影響

1、淺論ppGalNAcT2反義RNA對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901生物學(xué)特性的影響                   作者：金美芳， 邵雪軍， 吳士良【摘要】  目的： 研究人胃癌細(xì)胞SGC7901中多肽N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2 (ppGalNAcT2) 基因表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP2，TGF1表達(dá)的相關(guān)性，以及對(duì)細(xì)胞增殖和形態(tài)生物學(xué)特性的影響。方法： 用兩個(gè)已構(gòu)建好的反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901，通過418

2、篩選，建立一系列旨在封閉胃癌細(xì)胞SGC7901 ppGalNAcT2基因表達(dá)的亞細(xì)胞克隆。通過共聚焦顯微鏡，RTPCR檢測(cè)反義封閉ppGalNAcT2基因RNA表達(dá)后，胃癌細(xì)胞SGC7901中TGF1，MMP2表達(dá)水平，細(xì)胞增殖以及形態(tài)的變化。結(jié)果： 反義封閉ppGalNAcT2基因表達(dá)后, 胃癌細(xì)胞SGC7901 ppGalNAcT2的表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，分裂增殖減慢。結(jié)果還顯示，反義封閉ppGalNAcT2基因表達(dá)可使TGF1，MMP2基因在mRNA表達(dá)水平均增加，提示ppGalNAcT2基因表達(dá)可能對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。 結(jié)論： ppGalNAcT2

3、可能在腫瘤的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。 【關(guān)鍵詞】  SGC7901細(xì)胞； 多肽N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶; 基質(zhì)金屬蛋白酶; 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1   Abstract  Objective: To study the effect on the cell proliferation and the level of MMP2 and TGF1 in the SGC7901 cells caused by antisense blocking ppGalNAcT2 gene expressionMethods： The antisense expressing

4、 vectors of two different length ppGalNAcT2 gene segments were constructed and transfected into SGC7901 cells.A series of subcellular clones aiming at blocking of ppGalNAcT2 gene expression of SGC7901 cells were established by G418 selection.After antisense blocking, the cells were first tested with

5、 fluorescent microscopy.Then the expression of ppGalNAcT2，MMP2 and TGF1 gene cells growth were studied with RTPCR.The effects of ppGalNAcT2 antisense RNA on the proliferation of SGC7901 cells were tested by MTT.  Results： The results showed that ppGalNAcT2 level in SGC7901 cells was obviously r

6、edudced and the cell proliferation was slower after antisense blocking.It indicated that the blocking of ppGalNAcT2 gene expression had influence on SGC7901 cell proliferation.It was also revealed that the blocking of ppGalNAcT2 gene expression could increase the mRNA and protein level of MMP2 and T

7、GF1. Conclusion： The result suggests that ppGalNAcT2 has an important role in the cell proliferation, invasion and metastasis of cancer.   Key words  SGC7901 cell; polypeptide Nacetylgalactosaminyltransferase; matrix metalloproteinase; transforming growth factor1   糖蛋白的糖鏈按照其

8、連接方式的不同，分為兩大類：一類稱N連接型糖鏈，又稱N聚糖，主要存在于血漿蛋白和細(xì)胞膜及胞質(zhì)的糖蛋白中。另一類稱O連接型糖鏈，又稱O聚糖，主要見于分泌液中的糖蛋白，俗稱黏蛋白1。腫瘤細(xì)胞含有富含O聚糖結(jié)構(gòu)域的膜結(jié)合黏蛋白類糖蛋白，這些糖蛋白的基因表達(dá)具有細(xì)胞特異性并且在腫瘤細(xì)胞中常發(fā)生變異。有關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶的研究，以往人們較多地關(guān)注參與N糖苷鍵連接有關(guān)的酶，近年來隨著O糖基化相關(guān)酶新基因的發(fā)現(xiàn)和克隆，有關(guān)O糖基化產(chǎn)生的糖鏈結(jié)構(gòu)和功能的研究受到廣泛重視。多肽:N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶（polypeptide Nacetylgalactosaminyltransferase，ppGalNAcTs）是O

9、糖鏈合成第一步的糖基轉(zhuǎn)移酶，ppGalNAcT2是該家族中組織分布及底物譜較廣的成員，很有可能是O糖鏈合成的限速酶，有著重要的生物學(xué)意義2。   為了深入研究ppGalNAcT2的生物學(xué)功能，我們成功地構(gòu)建了ppGalNAcT2反義表達(dá)質(zhì)粒載體，反義封閉ppGalNAcT2基因表達(dá)3；我們也成功地構(gòu)建了ppGalNAcT2的RNA干擾真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞得到穩(wěn)定的ppGalNAcT2基因剔除細(xì)胞株4。為探討ppGalNAcT2在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用，本研究將ppGalNAcT2反義重組載體運(yùn)用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞SGC7901，得到封閉胃癌

10、細(xì)胞SGC7901細(xì)胞ppGalNAcT2基因表達(dá)的亞細(xì)胞克隆，并對(duì)其生長(zhǎng)繁殖及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子1（transforming growth factor1，TGF1）的表達(dá)進(jìn)行了初步研究。   1  材料與方法   1.1  材  料   人胃癌細(xì)胞株SGC7901為本室保存。反義重組載體pEGFPFDT2和pEGFPFXT2由本室構(gòu)建保存。RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco BRL公司， RTPCR試劑盒購于Pro

11、mega公司，轉(zhuǎn)染試劑盒G418選擇性抗生素購于Roche公司。PCR引物為上海博亞公司合成。NBT/BCIP染色試劑盒為華美生物工程公司產(chǎn)品，antihTGF1、antihMMP2及actin 單抗均為R&D公司產(chǎn)品。   1.2  方  法   1.2.1  重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞  pEGFPFDT2和pEGFPFXT2重組載體分別是將T2全長(zhǎng)序列1 716 bp和T2序列中的一片段753 bp經(jīng)酶切后反向連接入pEGFPC1載體中，分別形成反義重組載體pEGFPFDT2和pEGFPFXT2。

12、轉(zhuǎn)染前將SGC7901細(xì)胞接種于24孔板，加入不同濃度的G418觀察細(xì)胞的死亡情況，確定最低致死濃度。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶(1×106/ml)，于37，5CO2孵箱中孵育12 h后，按FUGENE6介導(dǎo)轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞的方法，將純化的重組質(zhì)粒和陰性空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞。72 h后加入G418溶液至終濃度為600 mg/L，培養(yǎng)2周左右直到出現(xiàn)抗G418細(xì)胞克隆。   1.2.2  共聚焦顯微鏡觀察  將蓋玻片置于6孔板中，把轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞培養(yǎng)于其中，待細(xì)胞長(zhǎng)到30%40的匯合度時(shí)棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕淋洗后，每孔

13、加1 ml 4低聚甲醛固定半小時(shí)后，吸出低聚甲醛，用PBS洗2遍，封片后置于共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的質(zhì)粒所表達(dá)的GFP熒光。   1.2.3  細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察  將未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染了反義重組載體pEGFPFDT2和pEGFPFXT2的細(xì)胞株分別命名為SGC7901，SGC79010，SGC7901FDT2，SGC7901FXT2，將4種細(xì)胞置于顯微鏡下，觀察其形態(tài)的變化，并拍照記錄。   1.2.4  相關(guān)基因的檢測(cè)  細(xì)胞總RNA的提取采用Trizol一步法。以所得到的細(xì)胞總RNA為模板，

14、使用Promega公司的試劑盒進(jìn)行RT反應(yīng)，得到cDNA。選用actin為內(nèi)對(duì)照，以各種細(xì)胞株的總RNA的RT產(chǎn)物為模板同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)轉(zhuǎn)染反義ppGalNAcT2的SGC7901細(xì)胞ppGalNAcT2，TGF1，MMP2等相關(guān)基因表達(dá)的變化。PCR反應(yīng)條件是94預(yù)變性4 min， 94變性50 s，55退火50 s，72延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，72再延伸10 min。PCR引物序列及預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如下（表1）。   1.2.5  MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖   取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞懸液后，計(jì)數(shù)細(xì)胞，將細(xì)胞調(diào)整到一定濃度后

15、，接種于96孔板上，每孔加200 l細(xì)胞懸液，每隔24 h隨機(jī)取4孔，各加MTT 50 l，5 h后小心吸去液體，加二甲基亞砜(DMSO) 150 l，待顯色后轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)儀上測(cè)定光密度值(490 nm)。以第1天的光密度值為1以后各天顯示值為與第1天之比值，作生長(zhǎng)曲線圖，觀察細(xì)胞增殖變化。    2  結(jié)  果   2.1  共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果   在共聚焦顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光（圖1），并發(fā)現(xiàn)GFP綠色熒光都集中于胞質(zhì)中，證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。表1   PCR引物

16、序列   2.2  轉(zhuǎn)基因細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果   熒光顯微鏡下可以看到轉(zhuǎn)染了反義RNA載體的細(xì)胞形態(tài)有所變化，相對(duì)于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染了空載體的細(xì)胞其形態(tài)更顯得梭長(zhǎng)，提示轉(zhuǎn)染反義重組載體可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)特性(圖2)。2.3  轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的變化   結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了pEGFPFDT2和pEGFPFXT2細(xì)胞ppGalNAcT2的mRNA表達(dá)明顯降低，而TGF1和MMP2的mRNA表達(dá)水平均相對(duì)增加(圖3)。顯示ppGalNAcT2可能與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。    

17、0;       3  討  論   ppGalNAcT及其家族作為黏蛋白O糖基化的起始酶，可能與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。我們觀察了ppGalNAcT2在8種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)譜后發(fā)現(xiàn)3，5，在人胃癌細(xì)胞株SGC7901中，ppGalNAcT2的表達(dá)較其他細(xì)胞要高。本研究通過轉(zhuǎn)染表達(dá)ppGalNAcT2反義RNA的質(zhì)粒，成功獲得了ppGalNAcT2表達(dá)受抑制的人胃癌細(xì)胞克隆，為研究該基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀＿M(jìn)一步的相關(guān)功能研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了ppGalNAcT2反義RNA的質(zhì)粒的SGC

18、7901細(xì)胞ppGalNAcT2 mRNA表達(dá)水平降低，TGF1，MMP2的mRNA表達(dá)水平均相對(duì)增加。由于TGF1，MMP2都與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及增殖相關(guān)，因此推測(cè)ppGalNAcT2與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及增殖密切關(guān)聯(lián)。   關(guān)于轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)相關(guān)的細(xì)胞因子，近年來研究較多的有IGF，TGF，EGF，IL6等。TGF1基因被認(rèn)為參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生等過程，在許多腫瘤組織中高表達(dá)。TGF1可促進(jìn)某些腫瘤細(xì)胞的局部浸潤(rùn)或腹膜播散，并削弱免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的排斥效應(yīng)6。TGF mRNA表達(dá)受多種因素的影響，近年的研究發(fā)現(xiàn)TGF mRNA的水平升高似乎與高糖的程度呈正相關(guān)7

19、，Ziyadeh等在體外研究中證實(shí)，高糖增強(qiáng)系膜細(xì)胞TGF mRNA的表達(dá)及活性，而在糖尿病研究中也發(fā)現(xiàn)非酶糖基化產(chǎn)物可促進(jìn)TGF1 mRNA的表達(dá)。本研究中轉(zhuǎn)染了表達(dá)ppGalNAcT2反義RNA的質(zhì)粒的SGC7901細(xì)胞TGF1的表達(dá)明顯高于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載的細(xì)胞?？赡艿脑蚴怯捎谝种屏思?xì)胞內(nèi)ppGalNAcT2的表達(dá)，酶促糖基化減少，而非酶糖基化增加，這樣同時(shí)增加了糖濃度和非酶糖基化產(chǎn)物。這兩個(gè)因素可促進(jìn)TGF1 mRNA表達(dá)相對(duì)增加。而TGF1又與MMP的表達(dá)密切相關(guān)，TGF1能誘導(dǎo)人類細(xì)胞株轉(zhuǎn)錄出高水平的MMPs mRNA8。有報(bào)道稱，在轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)TGF的過表達(dá)能抑

20、制良性皮膚瘤的形成，而對(duì)于皮膚癌卻能促進(jìn)其浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，并證實(shí)是MMPs合成增加所致9。在本研究中，ppGalNAcT2反義RNA能抑制ppGalNAcT2的表達(dá),而ppGalNAcT2表達(dá)水平的降低促進(jìn)了TGF1的表達(dá)，進(jìn)而可能促進(jìn)MMPs的合成。   TGF1是具有雙重調(diào)節(jié)作用的因子，體外實(shí)驗(yàn)證明TGF1是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的主要負(fù)性調(diào)控因子，TGF1與細(xì)胞表面受體結(jié)合，通過p53和PRB的低能磷酸化，抑制cmyc的表達(dá)，使細(xì)胞分裂停止，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)10,11。在本研究中，推測(cè)ppGalNAcT2的減少導(dǎo)致TGF1的合成增加進(jìn)而減慢了細(xì)胞的生長(zhǎng)。   我

21、們的工作還觀察到ppGalNAcT2對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分的黏附能力有影響12，因而有關(guān)ppGalNAcT2在整體動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移過程中的作用值得進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Dwek RA.Glycobiology:toward understanding the function of sugarsJ.Chem Rev，1996,96（2）:683-720.2 Iwasaki H, Zhang Y，Tachibana K，et al.Initiation of oglycan synthesis in IgA1 hinge region is dete

22、rmined by a single enzyme, UDPNacetylDgalactosamine:polypeptide Nacetylgalactosaminyltransferase 2J.J Biol Chem, 2003, 278（8）: 5613-5621.3 金美芳，劉可人，周嘉梁，等.人多肽：N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2基因反義RNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及克隆鑒定J.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2005，15（2）：100-103.4 仇 灝，劉可人，朱俐燕，等.人多肽：N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2（ppGalNAcT2）RNA干擾載體的構(gòu)建及鑒定J.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2007，17（2）：102-104.5 仇 灝，陳克平，周嘉梁，等.Northern雜交檢測(cè)多肽：N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2在不同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平J.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2005，15（1）：14-16.6 Massague J.The TGF family of growth and differentiation factorsJ.Cell, 1987, 49(4): 437-438.7 Iwano M, Kubo A, Nishino T,