血管內(nèi)皮生長因子反義核酸增強華蟾素誘導(dǎo)K562細胞凋亡

1、血管內(nèi)皮生長因子反義核酸增強華蟾素誘導(dǎo)K562細胞凋亡         11-01-07 11:46:00     編輯：studa20                     作者：陳麗梅，李超民，王懷宇，關(guān)鍵虹【摘要】  目的 研究VEGF反義核酸(ASON)增強華

2、蟾素對人慢性粒細胞白血病K562細胞株誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。方法 合成VEGF ASON轉(zhuǎn)染入K562細胞，4種濃度的華蟾素(1、3、5、7mg/L)作用于K562細胞株24、48、72h，應(yīng)用Western blot法檢測VEGF蛋白的表達，原位細胞凋亡(TUNEL)、流式細胞儀法(FCM法)檢測細胞凋亡。結(jié)果 不同劑量華蟾素組對K562細胞株均有抑制作用，并具有時間和濃度依賴性。經(jīng)VEGF ASON轉(zhuǎn)染的K562細胞株對華蟾素的誘導(dǎo)凋亡作用更加明顯。結(jié)論 華蟾素在體外一定濃度范圍內(nèi)可誘導(dǎo)K562細胞株凋亡，VEGF ASON可增強華蟾素誘導(dǎo)K562細胞凋亡的作用。 【關(guān)鍵詞】  華蟾素；

3、VEGF反義核酸；K562細胞；凋亡ABSTRACT: Objective  To study the vascular endothelium growth factor (VEGF) antisense oligonucleotide (ASON) Cinobufotalin in enhancing apoptosis induced by human chronic myeloid leukemia K562 cell line. Methods  The synthesis of VEGF ASON was transfected into the K562 ce

4、lls; Cinobufotalin of four concentrations (1, 3, 5 and 7mg/L) acted on the K562 cell line for 24h, 48h and 72h. Western blot was used to detect VEGF protein expression, while in situ apoptosis (TUNEL) and flow cytometry method (FCM method) were employed to detect the apoptosis. Results  The dif

5、ferent doses of Cinobufotalin all inhibited K562 cell line in time and dosedependent manners. K562 cell line transfected by VEGF ASON had a more pronounced induction of apoptosis. Conclusion  The in vitro Cinobufotalin at a certain range of concentration can induce apoptosis in K562 cell line,

6、and VEGF ASON enhances Cinobufotalins effect in inducing apoptosis of K562 cells.KEY WORDS: Cinobufotalin; VEGF antisense oligonucleotide; K562 cell; apoptosis華蟾素是中華大蟾蜍皮水溶性成分制成的注射液，具有清熱解毒、消腫止痛之功效。經(jīng)實驗研究及臨床試驗表明其有一定的抗腫瘤作用，且毒副作用小，使用安全可靠。目前，已應(yīng)用于肺癌、肝癌、胃癌等的輔助治療1。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelium growth factor,

7、 VEGF)與細胞凋亡的關(guān)系已被證實，通過導(dǎo)入VEGF反義核苷酸阻斷VEGF的表達能增強化療藥物誘導(dǎo)白血病細胞凋亡的作用2。為了進一步了解華蟾素對白血病細胞的作用及VEGF反義核苷酸能否增強其誘導(dǎo)凋亡作用，我們選取人慢性粒細胞白血病K562細胞株進行體外研究。1  材料與方法1.1  材料 人慢性粒細胞白血病細胞株K562由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所惠贈。華蟾素購于安徽金蟾生化股份有限公司。RPMI1640培養(yǎng)液為GIBCO公司產(chǎn)品；鼠抗人VEGF mAb、HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG購自Santa Cruise公司；原位細胞凋亡檢測試劑盒(產(chǎn)品編號MK1022)購自

8、華美公司，-20冷凍保存，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2  細胞培養(yǎng)K562細胞懸浮培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)為100mL/L加熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為50mL/L CO2，37飽和濕度。35d換液1次。取對數(shù)生長期細胞，進行實驗。1.3  合成VEGF硫代寡核苷酸 VEGF硫代寡核苷酸(ASON)的正義鏈和反義鏈序列分別為5CTATCAGCGCAGCTACTGC3(正義)和5GCAGTAGCTGCGCTGATAGTGC3(反義)，分別與VEGF cDNA前3個密碼子及其上游部位3個密碼子堿基序列互補與一致。隨機鏈由19個堿基隨機組合，其堿基成分

9、比例與反義鏈相同，序列為5CCTCGTCATGAGACACGTC3，經(jīng)基因庫檢索不與已有的已知編碼序列互補。3組寡核苷酸從DNA自動合成儀上由逐步法硫磷修飾合成硫代寡核苷酸，均為上海生物工程公司和上海細胞生物學(xué)研究所合成。1.4  脂質(zhì)體包裹寡核苷酸轉(zhuǎn)染K562細胞 3組寡核苷酸脂質(zhì)體復(fù)合物在聚苯乙稀管中配制，脂質(zhì)體和寡核苷酸的濃度分別為400mol/L和40mol/L。直接在培養(yǎng)細胞中分別加正義、反義及隨機寡核苷酸脂質(zhì)體復(fù)合物，至終濃度為1.5mol/L，37，50mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育48h。1.5  Westernblotting檢測VEGF蛋白

10、60;裂解經(jīng)三組寡核苷酸轉(zhuǎn)染的K562細胞，提取細胞溶解液的蛋白質(zhì)，120mg/L SDS PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用鼠抗人VEGF mAb作抗，HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG作抗，ECL熒光顯色。1.6  MTT法檢測華蟾素對K562細胞增殖的影響調(diào)細胞濃度至5×107/L，接種于96孔板，每孔200L，然后分別加入0、1、3、5、7mg/L的華蟾素20L，每種濃度設(shè)6個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于含50mL/L CO2及37飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于24、48、72h將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，加入新配制的1g/L MTT 50L，混勻，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h后，離心

11、(1000r/min，5min)，棄上清，每孔加DMSO 200L，震蕩10min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm處測定A值。計算抑制率：抑制率=(A對照-A實驗)/A對照×100%1.7  原位細胞凋亡的檢測 根據(jù)MTT實驗結(jié)果選擇華蟾素合適的作用濃度和作用時間，將華蟾素作用后的實驗組、對照組(分別為經(jīng)ASON轉(zhuǎn)染和未經(jīng)ASON轉(zhuǎn)染的K562細胞株)及空白組(無華蟾素作用)細胞涂片用40g/L多聚甲醛PBS液室溫固定15min，將涂片置于30mL/L H2O2 30min，以阻斷內(nèi)源性辣根過氧化物酶。涂片浸泡在SSC溶液 80 20min

12、，PBS洗2次，胰蛋白酶消化20min。TdT緩沖液孵育10min，TdT反應(yīng)液37孵育1h。涂片浸泡在SSC溶液10min，以終止反應(yīng)。過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素孵育30min，PBS洗2次。DAB顯色510min，蘇木精復(fù)染35min，常規(guī)脫水、透明和封片。1.8  流式細胞儀法(FCM法)檢測細胞凋亡  將實驗組與對照組懸浮細胞于離心管中制成單細胞懸液，1000r/min，離心5min，棄上清，用PBS緩沖液洗滌1次。將細胞重懸于PBS液中，調(diào)整濃度為1×109/L。用400目篩網(wǎng)過濾2次。制備的單細胞懸液用700mL/L乙醇固定，4保存過夜，離心棄上清，加200L RNAase于37水浴30min，再加入染色液PI(碘化丙啶600mg/L)500L混勻，置室溫下30min。FAC Calbur流式細胞儀測定熒光強度，激發(fā)波長488nm，用Cell Quest 及Modfit軟件分析細胞周期，確定細胞周期分布。計算細胞凋亡率：   細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/(凋亡細胞數(shù)+未凋亡細胞數(shù))×100%。1.9  統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)均以±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟