納豆芽孢桿菌液體發(fā)酵生產(chǎn)_聚谷氨酸(1)

1、納豆芽孢桿菌液體發(fā)酵生產(chǎn)-聚谷氨酸劉常金1,鄭煥蘭1,姜川2,楊婷 1,趙琤1(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,泰達(dá)BIO-X系統(tǒng)生物技術(shù)研究中心,天津 300457(2.天津城市建設(shè)學(xué)院環(huán)境與市政工程系,天津 300384摘要:本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto液體發(fā)酵生產(chǎn)-聚谷氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。結(jié)果表明,在25 g/L葡萄糖為碳源,15 g/L蛋白胨為氮源,谷氨酸鈉添加量20 g/L的基礎(chǔ)上,納豆桿菌在pH為7.5,接種量為2%,搖床轉(zhuǎn)速為150r/min, 裝液量為50mL/250mL三角瓶的條件下液體發(fā)酵4

2、8 h,發(fā)酵液的-PGA產(chǎn)量達(dá)到11.97 g/L。產(chǎn)物水解后,經(jīng)液相色譜檢驗(yàn),初步確定產(chǎn)物為-聚谷氨酸。利用SDS一PAGE電泳對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的分子量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果表明其并非是單一分子量的-PGA,而是多種不同分子量的混合體。關(guān)鍵詞:納豆芽孢桿菌;液體發(fā)酵;-聚谷氨酸;HPLC;SDS-PAGE中圖分類(lèi)號(hào):Q814.1;文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B;文章篇號(hào):1673-9078(200908-0935-05Production of -Poly Glutamic acid via Liquid Fermentation by Bacillus subtilis nattoLIU Chang-jin1, ZH

3、ENG Huan-lan1, JIANG Chuan2, YANG Ting1, ZHAO Cheng1(1.TEDA BIO-X Center for Systems Biotechnology, College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457,China(2.Department of Environmental and Municipal Engineering, TianjinInstitute of Urban Co

4、nstruction, Tianjin 300384, ChinaAbstract: The optimum liquid fermentation technology of -Poly Glutamic acid(produced by Bacillus subtilis natto was obtained through single factor and orthogonal experiments. The results showed that the yield of was 11.97g/L under the following optimum conditions: gl

5、ucose content 2.5%, peptone content 1.5%, monosodium glutamate content 2%, pH 7.5, fermentation time 48 hours, the shaking speed 150 rpm and sample volume 50 mL in 250 mL shaking flask. The hydrolysate of the product was analyzed by HPLC and determined as -PGA. SDS-PAGE showed that the hydolysate wa

6、s the mixture of -PGA with different molecular weights.Key words: Bacillus subtilis natto; Liquid femertation;-Poly Glutamic acid;HPLC; SDS-PAGE-多聚谷氨酸Poly-glutmic acid,-PGA是一種高分子氨基酸聚合物,最早于1913年在炭疽芽孢桿菌的細(xì)胞莢膜中發(fā)現(xiàn)。多聚谷氨酸(以下簡(jiǎn)稱(chēng)-PGA是由L-谷氨酸和L-谷氨酸或D-谷氨酸單體之間通過(guò)氨基和羧基形成肽鍵之后生成的聚酰胺1,2,3,其分子式如下: 作為一種高分子量的聚合物,-PGA的分子鏈

7、上有大量游離羧基,使其具有一般聚羧酸的性質(zhì),因此其有很強(qiáng)的吸水性。此外-PGA還具有增稠、乳化、凝膠、成膜、保溫、緩釋、助溶和黏接等功能4,5。本文對(duì)用納豆桿菌液體發(fā)酵生產(chǎn)-PGA的發(fā)酵條件的優(yōu)化,分離收稿日期:2009-04-02作者簡(jiǎn)介:劉常金,食品工程與生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系主任 純化及其結(jié)構(gòu)初步分析。1 材料與方法1.1 菌株納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto(本實(shí)驗(yàn)室保存,從日本納豆中分離得到。1.2 試劑所用試劑為均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。1.3 培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(g/L:蛋白胨10,NaCl 10,酵母提取物5,瓊脂粉20,pH 7.0。種子培養(yǎng)基(g/L:

8、蛋白胨10,NaCl 10,酵母提取物5。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L:葡萄糖20,蛋白胨10,谷氨酸鈉20,Na2HPO4 1,NaH2PO4 1,MgSO4 0.5,pH 7.0。1.4 液體種子制備及搖瓶培養(yǎng)935將斜面生長(zhǎng)的菌種用接種環(huán)接入到含50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中,搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min, 37 培養(yǎng)20 h后在以一定接種量接入到不同組成的發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。1.5 發(fā)酵液黏度的確定將發(fā)酵液離心去除菌體后,用NDJ-79型旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)檢測(cè)發(fā)酵液的黏度值。同樣,將提取物用一定量蒸餾水稀釋后檢測(cè)黏度。黏度單位為mPas。1.6 -PGA產(chǎn)量的確定稱(chēng)重法。1.7 生

9、物量測(cè)定方法6分光光度測(cè)定法。1.8 分析方法1.8.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化首先采用單因素實(shí)驗(yàn),初選各因素的合理范圍。在此基礎(chǔ)上,采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素主要包括:發(fā)酵總時(shí)間、pH值、味精添加量、搖床轉(zhuǎn)速和裝液量等。1.8.2 -PGA水解后的高效液相分析1.8.2.1 水解條件取0.02 g樣品,放入水解管中,加入10 mL 6 mol/L 的HCl,通入氮?dú)?維持10 min后封口。110 水解24 h,冷卻后移至10 mL容量瓶中。用超純水洗滌3次,定容、過(guò)濾后取濾液分析氨基酸含量。1.8.2.2 衍生方法衍生劑:2,4-二硝基氟苯;衍生緩沖液:42 g/L Na2CO3;定容緩沖

10、液:3.4 g KH2PO4加入到145.5 mL 0.1 mol/L NaOH,用水定溶至500mL。10 L樣品+150 L衍生緩沖劑+150 L衍生劑+690 L定容緩沖液,混勻,60 保溫1 h,0.45 m膜過(guò)濾后備用。液相色譜條件:Agilent 1100高效液相色譜儀, Agilent TC-Cl8色譜柱(4.6 mm×250 mm,流動(dòng)相A: V(乙腈:V(水=1:1,流動(dòng)相B:NaAc-HAc (pH 6.4,柱溫:30 ,流速0.8 mL/min,紫外檢測(cè)器,波長(zhǎng):200 nm,進(jìn)樣量20 L。1.8.3 發(fā)酵產(chǎn)物分子量的測(cè)定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-P

11、AGE:Bio-Rad 蛋白質(zhì)電泳儀,10%分離膠,5%濃縮膠。0.1%的考馬斯亮蘭染色液染色1h,5%的甲醇和7%的冰醋酸與水混合液脫色過(guò)夜。2 結(jié)果與分析2.1 發(fā)酵條件對(duì)-PGA產(chǎn)量的影響2.1.1 培養(yǎng)溫度的確定在裝液量50 mL/250 mL三角瓶、pH7.0、發(fā)酵時(shí)間48h、2%接種量、120 r/min振蕩培養(yǎng)的條件下,考察培養(yǎng)溫度分別為25 、30 、35 、37 、40 、42 時(shí)對(duì)-PGA粗品產(chǎn)量的影響,結(jié)見(jiàn)圖1。 圖1 培養(yǎng)溫度對(duì)-PGA產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of temperature on yield of -PGA如圖1所示:納豆菌在37的條件下,生物

12、量和-PGA粗品的產(chǎn)量達(dá)到最高值,這說(shuō)明在此溫度下菌體生長(zhǎng)過(guò)程中起作用的酶系和-PGA合成酶系活力都很高。故確定37為最適培養(yǎng)溫度。2.1.2 總發(fā)酵時(shí)間的確定在2.1.1的基礎(chǔ)上,考察不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)-PGA 粗品產(chǎn)量的影響。發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖2。 圖2 總發(fā)酵時(shí)間對(duì)-PGA產(chǎn)量的影響 Fig.2 Effect of total fermentation time on yield of -PGA 如圖2所示,發(fā)酵前48 h發(fā)酵粗提物產(chǎn)量不斷增加,48h后提取物不斷減少,說(shuō)明48 h后發(fā)酵液中的菌體已經(jīng)開(kāi)始分解目標(biāo)產(chǎn)物,所以實(shí)驗(yàn)取發(fā)酵48 h作為最佳發(fā)酵時(shí)間,進(jìn)行-PGA的發(fā)酵生產(chǎn)。2.1.3 初始

13、pH的確定在2.1.2的基礎(chǔ)上,考察發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)不同pH值(3.011.0對(duì)-PGA粗品產(chǎn)量的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基pH接近中性,聚谷氨酸因側(cè)鏈具有游離的羧基而帶有負(fù)電荷,并作為菌株莢膜的主要成分分泌至胞外,因而菌體表面帶負(fù)電荷,由于同性電荷相斥,菌體不易聚集,而穩(wěn)定懸浮于發(fā)酵液中。同時(shí)-PGA具有較高的分子量,在胞外不斷積累使發(fā)酵液具有很高的黏度,從圖3的三次平行實(shí)驗(yàn)可知,納豆菌在pH 7.58.5的范圍內(nèi)黏度最大,說(shuō)明此936937pH 范圍內(nèi)發(fā)酵液的黏性最高,發(fā)酵粗提物含量也相應(yīng)最高。選擇pH7.5為實(shí)驗(yàn)時(shí)的液體發(fā)酵pH 值。圖3 初始pH 對(duì)發(fā)酵液黏度的影響Fig.3 Ef

14、fect of initiative pH on fermentation viscosity2.1.4 接種量的確定在2.1.3的基礎(chǔ)上,考察接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%時(shí)對(duì)-PGA 產(chǎn)量的影響,見(jiàn)圖4。 圖4 接種量對(duì)-PGA 產(chǎn)量的影響 Fig.4 Effect of inoculums size on yield of -PGA由圖4可知,接種量為2%時(shí)-PGA 的產(chǎn)量最高,高于這個(gè)接種量則導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)過(guò)快、基質(zhì)缺乏或溶氧不足而造成-PGA 的產(chǎn)量下降;低于這個(gè)接種量由于發(fā)酵的適應(yīng)期延長(zhǎng),同樣造成-PGA 的產(chǎn)量下降。故確定2%為最佳接種量。 2.1.5 搖床轉(zhuǎn)速的確

15、定搖床轉(zhuǎn)速可以在一定程度上控制溶解氧的水平。在2.1.4實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,考察搖床轉(zhuǎn)速分別為0 r/min 、70 r/min 、120 r/min 、150 r/min 、180 r/min 、200 r/min 時(shí)對(duì)-PGA 產(chǎn)量的影響,結(jié)果見(jiàn)圖5。 圖5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)-PGA 產(chǎn)量的影響 Fig.5 Effect of shaking speed on yield of -PGA 由圖5可知,轉(zhuǎn)速為150 r/min 時(shí),-PGA 的產(chǎn)量最高,故確定150 r/min 為最佳轉(zhuǎn)速。 2.1.6 裝液量的確定在2.1.5 的基礎(chǔ)上,考察250 mL 三角瓶裝液量分別為20 mL 、30 mL 、

16、40 mL 、50 mL 、60 mL 、70 mL 、80 mL 、90 mL 時(shí)對(duì)-PGA 產(chǎn)量的影響,結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知,裝液量為50 mL 時(shí),-PGA 的產(chǎn)量最高,故確定實(shí)驗(yàn)最適裝液量為50 mL/250mL 三角瓶。 圖6 裝液量對(duì)-PGA 產(chǎn)量的影響 Fig.6 Effect of loading amount on yield of -PGA2.2 培養(yǎng)基組成對(duì)-PGA 產(chǎn)量的影響2.2.1 碳源對(duì)-PGA 產(chǎn)量的影響在不改變發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基其他條件的情況下,選擇葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、檸檬酸、可溶性淀粉、甘油為不同碳源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖7。

17、圖7 不同碳源對(duì)-PGA 產(chǎn)量的影響 Fig.7 Effect of carbon source on yield of -PGA如圖7所示,葡萄糖、蔗糖的發(fā)酵效果比其它碳源要好,而在這兩種碳源中,葡萄糖的發(fā)酵效果比蔗糖的稍好,選擇葡萄糖作為發(fā)酵生產(chǎn)的最佳碳源。 2.2.2 氮源對(duì)-PGA 產(chǎn)量的影響以葡萄糖為碳源,考察6種無(wú)機(jī)氮和3種有機(jī)氮分別做氮源時(shí)對(duì)-PGA 產(chǎn)量的影響,結(jié)果如圖8。從圖8知,添加蛋白胨的菌體生長(zhǎng)狀況最好,發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量最高,故確定其為最適宜的氮源。 938圖8不同氮源對(duì)-PGA 產(chǎn)量的影響 Fig.8 Effect of nitrogen source on yield

18、 of -PGA2.2.3 不同葡萄糖、蛋白胨和谷氨酸鈉濃度對(duì)-PGA 產(chǎn)量的影響根據(jù)營(yíng)養(yǎng)需求的不同,可將-PGA 生產(chǎn)菌分為兩大類(lèi):谷氨酸依賴(lài)型和非谷氨酸依賴(lài)型。文獻(xiàn)報(bào)道的生產(chǎn)實(shí)用菌一般都是谷氨酸依賴(lài)菌。如圖9,在培養(yǎng)基中添加2.5%的-谷氨酸鈉的-PGA 產(chǎn)量明顯高于未添加谷氨酸鈉的對(duì)照組。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葡萄糖和蛋白胨的最佳添加量為2%和1.5%。 圖9 三種因素不同濃度條件下的-PGA產(chǎn)量 Fig.9 Effects of concentrations of three factors on yield of-PGA2.2.4 正交試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取培養(yǎng)基中葡萄糖、蛋白胨和

19、谷氨酸鈉這三個(gè)主要因素進(jìn)行三水平正交試驗(yàn)(見(jiàn)表1。從表1知,在選定的因素水平內(nèi),對(duì)液體發(fā)酵-PGA 影響的主次順序?yàn)?谷氨酸鈉>葡萄糖>蛋白胨。8號(hào)試驗(yàn)組合-PGA 產(chǎn)量最高,再結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,因此,確定該菌的最佳發(fā)酵工藝為:葡萄糖25g/L ,蛋白胨15g/L ,谷氨酸鈉20g/L 。 2.3 -PGA 的分離提純液體發(fā)酵完后,發(fā)酵液在4000 r/min 離心10 min ,收集上清液,加34倍體積的預(yù)冷乙醇沉淀-PGA ,4 冰箱過(guò)夜,10000 r/min 離心20 min ,收集沉淀,凍干得到粗制品-PGA 。為了提純-PGA ,將乙醇沉淀的-PGA 再溶于生理鹽水

20、中,經(jīng)14000 Da 透析除鹽,再調(diào)pH 到23進(jìn)行等電沉淀,4 下10000 r/min 離心20 min ,沉淀凍干得到精制-PGA 產(chǎn)品。表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Table 1 Design and results of orthogonal testNo.Glucose (g/LPeptone (g/LMonosodium glutamate(g/LError item-PGA (g/L1 15 10 20 1 10.712 15 15 25 2 11.003 15 20 30 3 10.214 20 10 25 3 10.97 5 20 15 30 1 9.186 20 20

21、 20 2 10.057 25 10 30 2 9.158 25 15 20 3 11.979 25 20 2510.96K110.64010.27710.910 10.283 K210.06710.71710.977 10.067 K310.69310.4079.513 11.050 R 0.626 0.4401.4640.983 圖10 谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖Fig.10 HPLC chromatogram of pure glutamic acid2.4 發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC 分析 圖11 發(fā)酵產(chǎn)物水解液的HPLC圖Fig.11 HPLC chromatogram of hydrolys

22、ate of fermentationproduct將-PGA 水解后進(jìn)行高效液相色譜分析。由圖11發(fā)酵產(chǎn)物水解樣品左側(cè)第3個(gè)峰的出峰時(shí)間為6.10 min ,與圖10的L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間一致,可以表明水解產(chǎn)物是L-谷氨酸。右側(cè)為衍生劑峰。 2.5 SDS-PAGA 測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的分子量從圖12可知,發(fā)酵產(chǎn)物不是單一分子量的-PGA ,而是多種不同分子量的混合體。 圖12 發(fā)酵產(chǎn)物的SDS一PAGA電泳Fig.12 SDS-PAGE of fermentation product3 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)對(duì)納豆桿菌生產(chǎn)-PGA的液體發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。在25g/L葡萄糖為碳源,15g/L蛋白胨為氮源

23、,谷氨酸鈉添加量20g/L的基礎(chǔ)上,納豆桿菌在pH為7.5,接種量為2%,搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min,裝液量為50mL/250mL三角瓶的條件下液體發(fā)酵48 h,發(fā)酵液的-PGA產(chǎn)量達(dá)到11.97 g/L。產(chǎn)物水解后,經(jīng)液相色譜檢驗(yàn),初步確定產(chǎn)物為-聚谷氨酸。利用SDS一PAGE電泳對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的分子量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果表明其并非是單一分子量的-PGA,而是多種不同分子量的混合體?？梢园阉到獾揭欢ǚ肿恿康姆秶?以滿(mǎn)足對(duì)-PGA不同應(yīng)用產(chǎn)品的研究開(kāi)發(fā)。參考文獻(xiàn)1桑莉,徐虹,李暉等.-聚谷氨酸產(chǎn)生菌的篩選及發(fā)酵條件J.過(guò)程工程學(xué)報(bào).,2004年,4(5:462-4662王圣磊.產(chǎn)生-聚谷氨酸發(fā)酵的

24、條件分析J.齊魯藥事, 2006,25(7:437-4403Shih I L,Van Y T. The Production of Poly(-Glutamic Acidfrom Microorganism and Its Various Applications J.Bioresource Technology,2001,79:2072254施慶珊,許虹,林小平,等.-聚谷氨酸的微生物合成J.生物技術(shù),2004,14(1:65-675Maria Borbely ,Yukio Nagasaki, Janos Borb. Biosynthesis andchemical modification

25、 of poly(-glutamic acid PolymerJ.Bulletin,1994,32:127-1326梁淑娃,黃曉曼,夏楓耿等.納豆激酶液體深層發(fā)酵技術(shù)的研究J.現(xiàn)代食品科技,2007,23(6:1-3(上接第931頁(yè)11NicolaVolpi, Francesca Maccari. Purification andcharacterization of hyaluronic acid from the mollusc bivalveMytilus galloprovincialisJ. Biochimie,2003,85:619-625 12Mohamad Warda, Eman M. Gouda, Toshihiko Toid, et al.Isolation andcharacterization of raw heparin from dromedaryintestine: evaluation of a new source of pharmaceuticalheparinJ. Comp