CapLCESIQTOFMS分析前主要幾種樣品處理方法(參考

1、CapLC-ESI-Q-TOF-MS分析前主要幾種樣品處理方法（參考）12DE膠樣品膠上酶切將膠體蘭染色后凝膠中的蛋白質(zhì)點(diǎn)切下，用含50%乙腈，25mM 碳酸氫銨的溶液50-100L 浸泡膠片脫色，用真空離心干燥機(jī)SpeedVac (Savant)干燥20min，使膠片完全脫水體積縮小，加入60-80L 體積酶液(0.01 g/L，含25mMNH4HCO3)，4放置1小時后， 37 保溫16-18 小時，隨后在離心管中加入5%TFA(或FA)，50%ACN100L 于37 保溫1 小時，超聲10分鐘，吸出上清液，膠粒再加入2.5%TFA(或FA)，50% ACN 100L 于37 保溫1 小時

2、，超聲10分鐘，吸出上清液。合并上清液，用SpeedVac 冰凍干燥，-20保存。2. SDS-PAGE膠樣品膠上酶切將膠體蘭染色后凝膠中的蛋白質(zhì)條帶切下，將條帶切成1mm3大小的膠粒。用含50%乙腈，25mM 碳酸氫銨的溶液50-100L 浸泡膠粒脫色，用真空離心干燥機(jī)SpeedVac (Savant)干燥20min，使膠片完全脫水體積縮小。加入適量10mM DTT溶液，體積以覆蓋膠粒為宜，56保溫1小時，吸去上清。隨后加入適量55mM IAA溶液，體積以覆蓋膠粒為宜，室溫暗處放置1小時。吸去上清，用真空離心干燥機(jī)SpeedVac (Savant)干燥20min，使膠片完全脫水體積縮小。加入

3、60-80L 體積酶液(0.01 g/L，含25mMNH4HCO3)， 4放置1小時后，37 保溫16-18 小時，隨后在離心管中加入5%TFA(或FA)，50%ACN100L 于37 保溫1 小時，超聲10分鐘，吸出上清液，膠粒再加入2.5%TFA(或FA)，50% ACN 100L 于37 保溫1 小時，超聲10分鐘，吸出上清液。合并上清液，用SpeedVac 冰凍干燥，-20保存。3. 其他樣品（多肽或蛋白）用超純水或0.1%FA溶解成約10pmol/ L或0.5 g/ L，15000g離心20分鐘，取上清。CapLC-ESI-Q-TOF-MS蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)庫檢索方法（參考）1MASCO

4、T（網(wǎng)絡(luò)版）Mascot是最常用的蛋白質(zhì)鑒定中數(shù)據(jù)庫檢索的的搜索引擎之一，分為網(wǎng)絡(luò)版和本地版，其中網(wǎng)絡(luò)版是免費(fèi)使用的，具有數(shù)據(jù)庫檢索最基本的功能。打開mascot的MSMS數(shù)據(jù)檢索主界面（）各參數(shù)意義請參考MASCOT幫助文件（）對各個參數(shù)的常用參考值和簡單說明如下：Your name, Email 和Search title請自行填寫Database ，網(wǎng)絡(luò)版的mascot不提供自定義數(shù)據(jù)庫功能，只能使用它提供的數(shù)據(jù)庫，請根據(jù)需要選擇。對常用的兩個數(shù)據(jù)庫NCBInr和Swissprot兩個數(shù)據(jù)庫簡單說明如下：NCBInr是根據(jù)基因組數(shù)據(jù)翻譯得到的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫信息，相對蛋白質(zhì)條目比較多，但冗余

5、度高；Swissprot則是已知蛋白的數(shù)據(jù)庫，信息可靠，冗余度低，但條目較少。具體的信息還請參閱各自數(shù)據(jù)庫的說明。Taxonomy，蛋白種屬，請根據(jù)樣本的來源選擇。Enzyme，蛋白樣品酶切所使用的酶，請根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況選擇相應(yīng)的酶，最常用的是Trypsin。Allow up to n missed cleavages， 允許的最大漏切位點(diǎn)數(shù)，通常選擇1或2Fixed modifications， 固定修飾，對于做了還原烷基化處理的蛋白質(zhì)酶切樣品，請選擇上圖中的修飾，其他固定修飾請根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況添加Variable modifications，可變修飾，通常暴露在空氣中的樣品M都可能被氧化，因此

6、請選擇上圖中的修飾，其他可變修飾根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況添加，通常蛋白質(zhì)的各種修飾，如糖基化，磷酸化，乙?；鹊鹊男揎椚绻?，也在此添加。Quantitation，需要有付費(fèi)軟件的支持，蛋白質(zhì)鑒定選None。Peptide tol.和 MS/MS tol. ，根據(jù)產(chǎn)生數(shù)據(jù)的質(zhì)譜儀的分辨率填寫，CapLC-ESI-Q-TOF-MS的數(shù)據(jù)可以按上圖填寫。Peptide charge，根據(jù)產(chǎn)生數(shù)據(jù)的質(zhì)譜儀的離子源及采樣模式填寫，通常MALDI源正離子模式的質(zhì)譜數(shù)據(jù)填寫+1，ESI源正離子模式的質(zhì)譜數(shù)據(jù)填+2 and+3 或者更高。Monoisotopic or average，根據(jù)質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器是否能達(dá)

7、到單同位素分辨選擇，CapLC-ESI-Q-TOF-MS的數(shù)據(jù)選擇Monoisotopic。Data file，此處上傳質(zhì)譜數(shù)據(jù)文件，免費(fèi)的網(wǎng)絡(luò)版對上傳數(shù)據(jù)大小有限制，不能超過10M。Data format，根據(jù)質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)類型選擇，CapLC-ESI-Q-TOF-MS的數(shù)據(jù)可以按上圖填寫。Precursor， 如果知道需要鑒定的蛋白的大約分子量，可以在這里填，如果不知道則不填。Instrument，選擇質(zhì)譜儀的類型。Decoy，自動反轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)庫檢索功能Report top， 報(bào)告蛋白的數(shù)量，通常選擇AUTO，即MASCOT認(rèn)為合格的蛋白都輸出成報(bào)告，不合格的則不輸出，結(jié)果數(shù)據(jù)輸出格式為網(wǎng)頁格式。注：MASCOT本地版是付費(fèi)軟件，功能更強(qiáng)大，可以提供數(shù)據(jù)庫及修飾自定義功能