酵母發(fā)酵液催化不對稱還原反應(yīng)合成(S)(1)

1、酵母發(fā)酵液催化不對稱還原反應(yīng)合成(S)(1)】 目的：優(yōu)化酵母發(fā)酵液直接催化4氯乙酰乙酸乙酯(COBE)合成(S)4氯3羥基丁酸乙酯(S)CHBE)的反應(yīng)條件. 方法：考察酵母發(fā)酵液催化該反應(yīng)過程中基質(zhì)變化的規(guī)律，研究底物和能源供體對反應(yīng)的影響，并通過正交實驗設(shè)計法優(yōu)化反應(yīng)條件. 結(jié)果：在酵母發(fā)酵液催化COBE不對稱還原反應(yīng)的過程中，底物和還原糖消耗、產(chǎn)物合成相對集中在反應(yīng)的前期；反復(fù)分批式添加底物和蔗糖有利于反應(yīng)效率的提高；正交實驗優(yōu)化反應(yīng)條件的結(jié)果表明：酵母發(fā)酵液直接催化COBE不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE的最佳反應(yīng)條件為：蔗糖添加方式（反應(yīng)開始2 h后添加5 g/120 mL），底物

2、添加方式0.5(3)，緩沖劑添加量2 g/120 mL，環(huán)糊精添加量為2 g/120 mL，反應(yīng)后測定產(chǎn)物的產(chǎn)率達96%，ee(對映體過量值)達100%. 結(jié)論：通過反應(yīng)條件優(yōu)化提高了酵母發(fā)酵液的催化效果.【關(guān)鍵詞】 酵母發(fā)酵液；不對稱還原反應(yīng)；4氯乙酰乙酸乙酯；(S)4氯3羥基丁酸乙酯；正交實驗0引言近年來，通過生物催化劑1-3催化羰基化合物的不對稱還原反應(yīng)合成光學(xué)活性醇的相關(guān)研究備受關(guān)注. 其中，(S)CHBE是合成降血脂、降膽固醇、心血管藥及抗生素等藥物的光學(xué)活性中間體，市場需求很大. 有關(guān)利用酵母干細胞和基因工程菌催化COBE不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE的報道多為基礎(chǔ)性研究4-5.

3、 我們在前期研究酵母發(fā)酵液直接催化COBE不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE反應(yīng)的基礎(chǔ)上6，進一步考察反應(yīng)過程中基質(zhì)的變化規(guī)律和底物、能源供體及添加方式對反應(yīng)的不同影響，優(yōu)化反應(yīng)條件，為建立成熟的生產(chǎn)操作工藝條件奠定技術(shù)基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料Na2CO3為市售化學(xué)純，其他材料參照文獻6的實驗部分1.1試劑.1.2方法1.2.1目標化合物的合成路線酵母發(fā)酵液催化COBE的不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE的合成路線為：1.2.2生物催化劑制備參照文獻6實驗部分1.2的方法培養(yǎng)酵母發(fā)酵液作為生物催化劑.1.2.3酵母發(fā)酵液催化COBE不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE反應(yīng)條件和過程基本參考文獻6實

4、驗部分1.3 COBE的不對稱還原反應(yīng)，其中手性添加劑改為環(huán)糊精1.2 g，緩沖劑改為K2HPO4Na2CO3（8/2, m/m） 1 g, 其他反應(yīng)條件改為文獻6報道的優(yōu)化條件，即：酵母菌最佳培養(yǎng)時間為1618 h，最佳反應(yīng)溫度和pH值分別為2931和7.2.1.2.4底物和產(chǎn)物濃度測定參照文獻6實驗部分1.3.1.2.5反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率和光學(xué)純度的分析計算以產(chǎn)物產(chǎn)率（Y）和對映體過量值（ee）表示反應(yīng)的程度和產(chǎn)物的光學(xué)純度，其表達式分別如下：Y=nsCHBEnCOBE100%式中nCOBE為反應(yīng)初始時底物COBE的摩爾數(shù)，nsCHBE為反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物(S)CHBE的摩爾數(shù).ee=cS-cRcS

5、 cR100%，式中cS和cR分別為S型和R型產(chǎn)物的濃度.1.2.6還原糖測定采用DNS法.1.2.7酵母發(fā)酵液催化不對稱還原反應(yīng)（VCOBE=1.5 mL）的條件優(yōu)化采用正交實驗設(shè)計法安排實驗考察底物和蔗糖添加方式、環(huán)糊精和緩沖劑（K2HPO4Na2CO3（8/2，m/m）)添加量等因素對酵母發(fā)酵液催化1.5 mL COBE（相當于91 mmol/L）不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE反應(yīng)的影響. 底物添加方式分別考察： 一次性加入底物1.5 mL；反復(fù)分批式補加底物（包括: 開始時加入1.0 mL，在反應(yīng)進行2 h后再補加0.5 mL； 反應(yīng)開始時加入1.0 mL，反應(yīng)開始4 h后再補加0.

6、5 mL; 反應(yīng)開始時加入0.5 mL，后每間隔2 h加入0.5 mL兩次,即0.5 (3)）. 蔗糖添加方式分別考察： 一次性加入15 g；反復(fù)分批式補加（包括: 反應(yīng)開始時加入10 g，反應(yīng)進行2 h后再補加5 g； 反應(yīng)開始時加入10 g，反應(yīng)開始4 h后補加5 g等方式）. 選擇L9(34)正交表進行表頭設(shè)計、安排和實施試驗.統(tǒng)計學(xué)處理：用正交設(shè)計助手v3.1（專業(yè)版）統(tǒng)計軟件分析（F檢驗）實驗結(jié)果.2結(jié)果2.1COBE不對稱還原反應(yīng)過程中的基質(zhì)變化規(guī)律在酵母發(fā)酵液催化COBE不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE的反應(yīng)過程中，底物和產(chǎn)物隨反應(yīng)時間的變化規(guī)律（圖1）顯示：在酵母發(fā)酵液催化CO

7、BE不對稱還原反應(yīng)的過程中，底物和還原糖消耗、產(chǎn)物合成相對集中在反應(yīng)的前期，在反應(yīng)開始前4 h內(nèi)，底物消耗快，產(chǎn)物生成多，在反應(yīng)后期，兩者的變化都不是很明顯；還原糖在反應(yīng)開始后的前3 h內(nèi)下降很快，后期的變化不明顯. 因此,在反應(yīng)條件控制優(yōu)化中注意反應(yīng)過程前期工藝條件的控制，降低反應(yīng)的初始底物濃度，提高反應(yīng)效率. 從多次實驗看，反應(yīng)時間為7 h為好.【關(guān)鍵詞】酵母發(fā)酵液；不對稱還原反應(yīng)；4Optimization for the asymmetric synthesis of (S)ethyl 4chloro3hyd 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文

8、版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。2.2底物濃度和添加方式對反應(yīng)的影響以酵母發(fā)酵液催化不同濃度COBE的不對稱還原反應(yīng)，結(jié)果（圖2）顯示，隨著COBE的濃度增大，反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率先是增大，然后逐漸減小，產(chǎn)物光學(xué)純度隨著底物濃度的增大一直遞減；當?shù)孜餄舛瘸^一定值（1.4 g/100 mL）時，底物殘留量逐漸增多.為了增大底物的投放量，將1.5 mL COBE分別采用不同的方式添加后進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果顯示：一次性加入底物1.5 mL（方式）時，底物殘留59.4%，產(chǎn)物產(chǎn)率和光學(xué)純度分別為67.5%和84.0%；反復(fù)分批式補料

9、的三種方式對反應(yīng)較為有利，以方式添加底物時，即反應(yīng)開始時加入1.0 mL，反應(yīng)開始4 h后補加0.5 mL，反應(yīng)結(jié)束后底物殘留稍多，產(chǎn)物產(chǎn)率和光學(xué)純度分別達到86.0%和89.5%；其他兩種反復(fù)分批式補料方式比以方式添加底物時對反應(yīng)更為有利. 為了提高底物的初始濃度，在以下的多因素優(yōu)化實驗中，考察當以方式和反復(fù)分批式方式和分別添加底物時對反應(yīng)的影響.2.3能源供體對反應(yīng)的影響考察五種能源供體對酵母發(fā)酵液催化還原反應(yīng)的不同影響，結(jié)果(圖3)顯示: 以蔗糖為能源時，酵母發(fā)酵液催化COBE還原生成(S)CHBE的產(chǎn)率和對映體過量值最高，底物殘余量最少，以乙醇作為能源供體時，反應(yīng)的產(chǎn)率和對映體過量值很

10、低，但是組間比較沒有顯著性. 由于乙醇作為酵母菌生物催化還原反應(yīng)的產(chǎn)物之一，可能會抑制酵母菌轉(zhuǎn)化酶的活性. 反應(yīng)過程中觀察到以乙醇為能源供體時，底物殘留量大，刺激性氣味濃，沒有酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)時的固有香味. 以下實驗，以蔗糖作為酵母發(fā)酵液催化COBE不對稱還原反應(yīng)的能源物質(zhì).考察了能源供體蔗糖的濃度對酵母發(fā)酵液催化不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE的影響，結(jié)果(圖4)顯示：增加蔗糖濃度在一定范圍內(nèi)有利于反應(yīng)效率的提高，當蔗糖濃度超過12.5 g/100 mL(即15 g/120 mL)時，可以觀察到在反應(yīng)體系中有蔗糖顆粒的存在，隨著反應(yīng)的進行，過量的蔗糖會逐漸溶解，但反應(yīng)體系溶液的粘度很大，產(chǎn)物提

11、取困難. 綜合而看，蔗糖的初始濃度以8.33 g/100 mL（即10 g/120 mL）較好.考察了以不同的方式補加蔗糖時，對酵母發(fā)酵液催化COBE不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE的影響, 結(jié)果顯示:以方式添加蔗糖時，不利于酵母發(fā)酵液催化COBE的不對稱還原反應(yīng)，在反應(yīng)中可以觀察到蔗糖顆粒的存在；反復(fù)分批式（repeated feeding strategy）添加能源有利于酵母發(fā)酵液的催化反應(yīng)，其中以方式添加時，底物殘留少，產(chǎn)物產(chǎn)率和ee值分別為89.0和94.0；以方式添加時，底物殘留多，產(chǎn)物產(chǎn)率和ee值分別只達到43.0和23.0. 蔗糖對酵母發(fā)酵液催化還原作用的影響主是通過代謝提供輔酶

12、，但反應(yīng)體系中如果存在過量的蔗糖可能會抑制酵母菌及酶的活性，增加反應(yīng)溶液的粘度，影響反應(yīng)效率的提高.2.4酵母發(fā)酵液催化不對稱還原反應(yīng)（VCOBE=1.5 mL）的條件優(yōu)化結(jié)合文獻6和單因素的實驗考察結(jié)果，正交實驗設(shè)計的因素和水平按照表1設(shè)置. 選用統(tǒng)計軟件正交設(shè)計助手v3.1的L9(34)正交表進行表頭設(shè)計、安排、實施和分析試驗（表2）.表1酵母發(fā)酵液催化合成(S)CHBE的正交實驗設(shè)計因素水平表（略）表2酵母發(fā)酵液催化不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE的正交試驗與結(jié)果（略）應(yīng)用正交設(shè)計助手v3.1的極差和方差分析模塊分析的數(shù)據(jù)顯示：底物添加方式對反應(yīng)的影響最大（R值最大，F(xiàn)檢驗P0.05），

13、蔗糖的添加方式次之，緩沖劑添加量的影響最??；正交實驗設(shè)計的因素作用效應(yīng)圖（圖略）顯示，酵母發(fā)酵液直接催化COBE不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE的最佳反應(yīng)條件（反應(yīng)體系體積120 mL）為：蔗糖添加方式（反應(yīng)開始2 h后添加5 g），底物添加方式為0.5(3)，緩沖劑添加量為2 g，環(huán)糊精添加量為2 g.按照最佳反應(yīng)條件的組合安排進行實驗，反應(yīng)結(jié)束后測定產(chǎn)物的產(chǎn)率達96%，ee高達100%.3討論有關(guān)細胞或酶催化不對稱還原反應(yīng)的細胞反應(yīng)動力學(xué)的報道很少，尤其對于能源供體和底物消耗、產(chǎn)物合成之間的關(guān)系很少涉及. 一次性添加底物和能源物質(zhì)限制了底物濃度的進一步增大和反應(yīng)效率的提高7-8. 我們通過

14、考察酵母發(fā)酵液催化COBE還原生成(S)CHBE反應(yīng)過程中基質(zhì)消耗和產(chǎn)物生成、還原糖的變化規(guī)律，以及底物和還原糖的添加方式對其催化反應(yīng)的影響，通過反復(fù)分批式流加底物，降低了COBE對細胞的毒害，并通過流加蔗糖，提高了反應(yīng)的效率，這為進一步建立和優(yōu)化酵母發(fā)酵液催化不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE的生產(chǎn)操作工藝奠定了技術(shù)基礎(chǔ).我們報道過在酵母發(fā)酵液催化COBE的不對稱還原反應(yīng)過程中，COBE可能部分水解導(dǎo)致反應(yīng)體系pH下降，影響細胞或酶的活力，通過添加適量的緩沖劑有利于降低這種不利影響，使反應(yīng)持續(xù)進行6；而且，緩沖劑的緩沖范圍和用量、底物的濃度和添加方式以及手性添加劑的添加量之間存在著一定的關(guān)系.

15、 通過正交實驗設(shè)計方法對這些影響這類反應(yīng)的多因素進行優(yōu)化和分析，可以綜合考慮這些因素對酵母發(fā)酵液催化COBE不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE的影響，進一步提高反應(yīng)效果，這對于建立酵母發(fā)酵液催化COBE不對稱還原反應(yīng)合成(S)CHBE的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)器操作模式和操作工藝很有意義，對于建立酵母發(fā)酵液催化含鹵類的羰基化合物的反應(yīng)體系和其他細胞包括基因工程菌培養(yǎng)液直接催化同類型底物合成手性藥物的研究有借鑒意義.【參考文獻】1Yamamoto H, Matsuyama A, Kobayashi Y. Synthesis of ethyl (S)4chloro3hydroxylbutanoate using

16、 fabGhomologuesJ. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 61:133-139.2Engelking H, Pfaller R, Wich G，et al. Stereoselective reduction of ethyl 4chloroacetoacetate with recombinant Pichia pastorisJ. Tetrahedron: Asymmetry， 2004,15(22): 3591-3593.3Erdelyi B, Szabo A, Seres G, et al. Stereoselectiv production

17、 of (S)1aralkyl and 1arylethanols by freshly harvested and lyophilized yeast cells J. Tetrahedron: Asymmetry, 2006, 17(23):268-274.4Cramarossa MR, Nadini A, Bondi M, et al. Biocatalytic reduction of ( ) and (-)carvone by bacteriaJ. Comptes Rendus Chimie, 2005,8(5):849-852.5Chen JH, Wang KP, Houng JY, et al. Sequential design of pH profiles for asymmetric bioreduction of ethyl 4chloro3oxobutyrate using a new experimental design methodJ. Enzyme Microbiol Technol, 2006, 38(5):689-696.【關(guān)鍵詞】酵母發(fā)酵液；不對稱還原反應(yīng)；4Optimization for the asymmetric synthesis of (S)ethyl 4chloro3hyd 本篇論文是由