飼料中營養(yǎng)物質(zhì)或有毒有害物質(zhì)檢測方法的研究進(jìn)展2

1、某種飼料中營養(yǎng)物質(zhì)或有毒有害物質(zhì)檢測方法的研究進(jìn)展 Some kind of feed nutrients or toxic substances detection methods research作者：李常銀Author: Lee Silver地址：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院Address: College of Veterinary Medicine of Sichuan Agricultural University, 郵編：652000Code: 652 000某種飼料中營養(yǎng)物質(zhì)或有毒有害物質(zhì)檢測方法的研究進(jìn)展 摘要:飼料是發(fā)展養(yǎng)殖業(yè)得物質(zhì)基礎(chǔ)，飼料成本占養(yǎng)殖生產(chǎn)成本的70%左右，掌握飼

2、料中的營養(yǎng)物質(zhì)或有毒有害物質(zhì)檢測方法是取得生產(chǎn)效益和經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。隨著飼料工業(yè)、動(dòng)物營養(yǎng)科學(xué)和分析檢測技術(shù)研究的不斷深入發(fā)展，對分析測試的項(xiàng)目和分析手段也要求越來越嚴(yán)格，為了確保動(dòng)物食品安全生產(chǎn)，在加入WTO 后，我們更注重了飼料安全性與世界接軌，在這方面已經(jīng)受到了國家和各級政府的高度重視。為了加強(qiáng)對飼料、飼料添加劑的管理，提高飼料、飼料添加劑的質(zhì)量，保障動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全，維護(hù)公眾健康，應(yīng)對綠色壁壘已成為工業(yè)制造業(yè)發(fā)展進(jìn)程中一場持久而艱巨的拉距戰(zhàn)，而有毒有害限用物質(zhì)的檢測便是其中至關(guān)重要的一環(huán)。本文主要介紹飼料中營養(yǎng)物質(zhì)或有毒有害物質(zhì)的檢測方法，總結(jié)有毒有害物質(zhì)的研究進(jìn)程。文章引用了

3、他人的研究方法，主要說明不同方法的研究進(jìn)展，以檢測有毒有害物質(zhì)為重點(diǎn)，飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的測定為輔助，把握了當(dāng)代科技技術(shù)的研究方法，有毒有害物質(zhì)包括了天然有毒有害物質(zhì)和人工合成的有機(jī)藥物，這些藥物不僅對動(dòng)物有很大的影響，還對人體有危害作用，所以說掌握飼料中有毒有害物質(zhì)的研究有益于我們的身體健康。關(guān)鍵詞:表關(guān)代謝能；蛋白代謝率；毒害作用；飼料；有毒有害物質(zhì); 檢測方法; 進(jìn)展1. 飼料中蛋白質(zhì)參假的測定1.1飼料中添加三聚氰胺定性鑒定和定量分析111測定飼料中添加三聚氰胺定性的步驟：建立模型測定光譜設(shè)置參數(shù)建立和檢驗(yàn)?zāi)Ｐ头治鰳悠窚y定未知樣品調(diào)用模型分析結(jié)果12 飼料中三聚氰胺的檢測方法1.21定性檢

4、測1.211氨基酸分析方法對于魚粉等蛋白質(zhì)原料中氨基酸的判定，可以從氨基酸總量和平衡性進(jìn)行分析。對于純化的蛋白質(zhì)，在水解過程中氨基酸殘基結(jié)合水分子成為游離的氨基酸，氨基酸總量大于蛋白質(zhì)的總量。但是，在進(jìn)行氨基酸分析時(shí)，一般是采用酸水解的方法對蛋白質(zhì)水解后再進(jìn)行分析，而在水解過程中部分氨基酸如色氨酸、苯丙氨酸等被破壞，使氨基酸總量下降。因此，對于一般的魚粉和其他蛋白質(zhì)原料的氨基酸分析結(jié)果，要求氨基酸總量為蛋白質(zhì)質(zhì)量的90以上，能夠達(dá)到95以上為最好。缺點(diǎn)是對于摻人不同處理的羽毛粉、豬蹄角粉、血粉等蛋白質(zhì)原料，單從氨基酸總量和氨基酸平衡性方面是難以進(jìn)行分析和判定的。1.212 離體消化率測定方法常

5、規(guī)離體率、國標(biāo)中消化率測定方法是經(jīng)過酶水解后進(jìn)行過濾、離心，測定殘?jiān)械牡鞍踪|(zhì)含量，再通過消化前、后樣品中蛋白質(zhì)含量的差異計(jì)算的，測定的是溶解于消化液中的所有含氮物質(zhì)的量。因此若在蛋白質(zhì)原料中摻人的非蛋白質(zhì)物質(zhì)能夠溶解或部分溶解，則測定的消化率就會(huì)高于真實(shí)結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)原料中摻人不同處理的羽毛粉、豬蹄角粉、血粉時(shí)，可以采用這種方法進(jìn)行鑒定。1.22定量檢測1.221 高效液相色譜法該方法的原理是試樣中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，將提取液離心后經(jīng)混合型陽離子交 摘自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所飼料分析及質(zhì)量檢測技術(shù)課件 作者：吳彩梅、吳秀群、賈剛等 2007年農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY T13722

6、007飼料中三聚氰氨的測定，本標(biāo)準(zhǔn)引用于此處。換固相萃取柱凈化，洗脫物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色譜儀進(jìn)行測定。樣品前處理：準(zhǔn)確稱取025 g粉碎均勻的樣品于50 mL有蓋的塑料離心管中，加入乙腈和水各25 mL，在旋渦混合器中混勻1 min后超聲20 min，再在旋渦混合器中混勻1 rain，離心5 min后取上清液過02汕m 濾膜。吸取濾液025 mL 并加人01 mol ·L 。的鹽酸075 mL ，混勻后過02 I zm 濾膜，在高效液相色譜儀上進(jìn)行測定。標(biāo)準(zhǔn)液制備：稱取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品01 g ，置于100 mL 容量瓶中，用甲醇溶液溶解，稀釋至刻度，得1 000斗g

7、·mL 。1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確吸取儲(chǔ)備液10 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得100 txg·mL_標(biāo)準(zhǔn)中間液；分別吸取中間液5、10、25、50 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得濃度分別為5、10、25、50 I Lg ·mL 。的標(biāo)準(zhǔn)液。液相色譜：色譜柱：EclipseXDB C 。(150 mm ×46 mm ，50 I zm ；流動(dòng)相：乙腈：緩沖液=85：15，其中緩沖液為10 mol ·L 。1檸檬酸和10 mol ·L 1庚烷磺酸鈉的混合液，pH=30；流速：08 mL ·min 。1；

8、進(jìn)樣體積：10¨L ；柱溫：25 oC；檢測波長：240nm 保留時(shí)間：約45 min；運(yùn)行時(shí)間：10 min。計(jì)算公式：X=C·V ·n m 式中：x 一試樣中三聚氰胺的含量mg ·kg 一；c 一標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的試樣中三聚氰胺的濃度txg ·mL 。；V 一凈化后加入的甲醇溶液體積mL ；m 一一試樣質(zhì)量，g ；n 一稀釋倍數(shù)。該操作復(fù)雜但精密，可以用于測定低濃度的三聚氫胺。1.222 氣相色譜一質(zhì)譜檢測法該方法的原理是凈化后的洗脫液用氮?dú)獯蹈?，用N ，O 一雙三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA衍生化，以氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行定性和定量測定

9、。根據(jù)液相的定量結(jié)果將洗脫液濃度稀釋至為05 Ixg ·mL 。分別吸取稀釋液05 mL 用氮?dú)獯蹈?，加入吡?50汕L 和衍生試劑250 IxL ，加蓋，混勻，70反應(yīng)30 min，同時(shí)吸取05 Ixg·mL 。的標(biāo)準(zhǔn)溶液05 mL做同步衍生，用氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀確證。此外，還有很多方法可以用來檢測飼料中的三聚氫胺。1.3 尿素、銨鹽、硝酸鹽-亞硝酸鹽的快速定性檢測操作：粗稱2g 上述脫脂樣品于試管中，加10mL 蒸餾水，用渦旋混合器混合1015s ，靜置10min ，取用上清液測非蛋白氮。1.3.1 尿素的快速定性檢測。1.3.1.1 先加68滴上清液到白色點(diǎn)滴板上，

10、然后加23滴0.1%溴百里酚蘭和45滴0.4%尿素酶到白色點(diǎn)滴板上，觀察顏色變化情況。若為陽性反應(yīng)結(jié)果呈藍(lán)色，陽性最低檢測限是0.25%。1.3.1.2 取試樣5g 左右，置于一張干凈的濾紙上，再加入5g 左右的生豆粉，攪拌均勻，用蒸餾水潤濕，滴入數(shù)滴甲酚紅試劑，讓其反應(yīng)35min ，若有尿素存在即顯出紅色，且散開得像蜘蛛網(wǎng)似的，無尿素則顯出黃色。1.3.2 銨鹽快速定性檢測加68滴上清液到點(diǎn)滴板上，然后滴加23滴奈斯勒試劑，觀察顏色變化結(jié)果。陽性反應(yīng)的結(jié)果：開始為黃色，逐漸變?yōu)樯罱凵?，一?huì)就變灰色，若只出現(xiàn)深桔色、基本不變色或由黃色直接變?yōu)榛疑蚝芸熳優(yōu)榛疑?，則是陰性。最低檢測限是0.1%。

11、1.3.3 硝酸鹽-亞硝酸鹽的快速定性檢測加68滴上清液到點(diǎn)滴板上，然后加23滴0.5%二苯胺，觀察顏色變化結(jié)果。陽性反應(yīng)的結(jié)果：在點(diǎn)滴板中間是深藍(lán)色，最低檢測限是0.05%。1.4 脲醛聚合物的快速定性檢測 本方法也可稱為三聚氰酸法 飼料博覽·技術(shù)版2D 2009年第5期1.4.1 樣品過45目篩， 加68滴0.5%變色酸到點(diǎn)滴板上， 取一些篩下樣品也加到點(diǎn)滴板上，往點(diǎn)滴板上再加0.5%變色酸，觀察顏色變化結(jié)果。陽性反應(yīng)的結(jié)果：在510min 內(nèi)，出現(xiàn)藍(lán)紫色，缺點(diǎn)是最低檢測限是0.15%，動(dòng)物性原料必須脫脂才能進(jìn)行測定。1.4.2 稱3g 樣品加到50mL 帶蓋離心管中，加35mL

12、 煮沸的20% NaOH溶液，用渦旋混合器混勻，靜置大約5min ，倒掉上清液，留下底部沉淀，加35mL 蒸餾水，混合，靜置5min ，倒掉上清液，反復(fù)洗34次，洗到沉淀無色（白到灰色），用蒸餾水將沉淀轉(zhuǎn)移到10mL 的試管中，吸出試管內(nèi)大部分水，僅留1cm 高的水。加1mL 0.5%變色酸，混勻，再觀察顏色。陽性反應(yīng)的結(jié)果：藍(lán)紫色，缺點(diǎn)是最低檢測限是0.25%，并且僅動(dòng)物性原料。以上的方法中對非蛋白質(zhì)含氮化合物快速檢測方法結(jié)合了感官檢測、顯微鏡檢測、物理、化學(xué)和生物學(xué)檢測，各種檢測方法相輔相成。在實(shí)踐中經(jīng)過多次和傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)檢測方法對比，上述檢測方法更簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、檢測結(jié)果直觀、

13、技術(shù)易掌握，甚至非專業(yè)人員都可掌握，這就是很好的優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是精確度不都是很高。2.1 飼料中有毒有害物質(zhì)的有機(jī)氯類農(nóng)藥。如六六六、滴滴涕等，沙門氏菌對人和動(dòng)物有致病力。飼料霉變主要由黃曲霉屬、青霉屬、交鏈孢霉屬、鐮刀霉屬等引起。霉菌不僅僅會(huì)影響飼料質(zhì)量，影響動(dòng)物正常生長，最嚴(yán)重的是產(chǎn)生毒素，引起動(dòng)物中毒。飼料添加劑包括維生素、微量元素、氨基酸和藥物添加劑等，大多數(shù)來自自然產(chǎn)物和人工合成，部分具有毒副作用，在添加量過大時(shí)，對動(dòng)物產(chǎn)生毒害作用。銅中毒時(shí)，大量銅在肝臟蓄積，抑制多種酶的活性，引起肝壞死。違禁藥物包括激素類、安定類和抗生素類藥物。如鹽酸克倫特羅，又稱瘦肉精，主要添加在育肥豬飼料中，能夠

14、提高豬的瘦肉率。添加后一方面是引起豬只體代謝異常，影響豬只的正常生長，嚴(yán)重的出現(xiàn)死亡；另一方面是在動(dòng)物產(chǎn)品中殘留，人食用后，會(huì)造成二次中毒，危害人體健康。22 快速檢測方法的應(yīng)用現(xiàn)在飼料中有機(jī)農(nóng)藥的檢驗(yàn)的手段與方法多種多樣，檢測儀器也越來越靈敏，檢測方法的檢測限量也越來越低。快速檢測法因其檢測所需的時(shí)間短、儀器要求簡單、結(jié)果判別容易人員技術(shù)要求低、對環(huán)境沒有特別的要求。一般的快速檢測產(chǎn)品都可滿足飼料檢測的要求，得到檢測人員的一致認(rèn)同，同時(shí)解決了基層檢測的技術(shù)困難，既快速又簡便，還可明顯降低檢測成本。2.2.1 酶聯(lián)免疫檢測法（ELISA ）ELISA principle is to use i

15、mmunology antigen antibody specificity combination of enzyme catalysis and high efficiency through chemical method will plant horseradish peroxidase (HRP and test object union, form enzyme coupling objects. Enzyme league immune detection kit is a lot of variety, the variety of dipsticks not too much

16、, main can meet essence, chloromycetin, lean lean, hormone, stability and sulfonamides common drug residue detection.（ELISA 法原理是利用免疫學(xué)抗原抗體特異性結(jié)合和酶的高效催化作用，通過化學(xué)方法將植物辣根過氧化物酶（HRP ）與檢測物結(jié)合，形成酶偶聯(lián)物。酶聯(lián)免疫檢測試劑盒已經(jīng)有很多的品種，試紙條的品種還不算太多，主要可滿足瘦肉精、氯霉素、磺胺、激素、安定等常見藥物殘留的檢測。）2.2 免疫金技術(shù) 摘自Determination of residues of zearalan

17、ol, -zearalanol, -zearalenol, -zearalenol, zearalanone and zearalenone in foodstuffs of animal origin - LC-MS/MS method GB/T 21982-2008免疫金技術(shù)即是用膠體金標(biāo)記抗原抗體反應(yīng)，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見帶顏色的斑點(diǎn)，因而可用于定性或半定量的快速檢測技術(shù)。該技術(shù)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)品往往檢測試紙的形式出現(xiàn)，目前已經(jīng)上市的產(chǎn)品有沙門氏菌等微生物檢測試紙、氯霉素等抗生素檢測試紙、磺胺檢測試紙和藥物殘留瘦肉精檢測試紙等，而且品種在不斷增加。2.3 篩選法用于大量

18、樣品的高通量分析，目的是檢測某種或某類危害物是否存在，其簡單、快速、不需要特殊的場地、不需要大型儀器設(shè)備和專門的人才，花費(fèi)一般也比較低。而當(dāng)前出現(xiàn)的眾多檢測- 激動(dòng)劑、性激素、氯霉素、磺胺藥、霉菌毒素和反芻動(dòng)物蛋白的各種試劑盒則大多屬ELISA 法。由于ELISA 具有抗原- 抗體特異反應(yīng)，又有足夠的靈敏度，所以對其的要求主要是不出現(xiàn)假陰性和盡可能少的假陽性。篩選法只能定性，回答是或否，至多給出半定量的結(jié)果。2.4 確證法該法是對篩選法定為陽性反應(yīng)的樣品做出進(jìn)一步檢測，能給出確信無疑的結(jié)論和結(jié)果，常用于殘留分析及禁用獸藥的定性與定量分析。2.5 定量法其任務(wù)是給出待測物的定量結(jié)果，大多用于法律

19、法規(guī)準(zhǔn)用但限量的藥物、添加劑或其他危害物的測定。常用的技術(shù)有紫外- 可見光分光光度法（UV- VIS ）、熒光分光光度法、原子吸收分光光度法（AAS ）、誘導(dǎo)耦合等離子發(fā)射光譜法（ICP ）、薄層色譜法（TLC ）等。盡管光譜法和色譜法，特別是色譜法也可給出定性的信息，但一般不用于確證。定量法應(yīng)有足夠低的定量限、準(zhǔn)確度和精密度。3. 飼料中天然有毒有害物質(zhì)的檢驗(yàn)3.1飼料中異硫氰酸酯含量的測定3.1.1氣相色譜法配合飼料中存在的硫葡萄糖苷，在芥子酶作用下生成相應(yīng)的異硫氰酸酯，用二氯申烷提取后，再用氣相色譜測定。其缺點(diǎn)是需要用到色譜柱：玻璃，內(nèi)徑3mm ，長2m 固定液：20FFAP(或其他效果

20、相同的固定液 ；載體：Chromosorb W ，HP ，0.180.15mm 孔篩(或其他效果相同的載體 ；柱溫：100；進(jìn)樣品及檢測器溫度：150；載氣：氮?dú)?；流速?5ml min 等條件，優(yōu)點(diǎn)是測量精確。3.1.2銀量法菜籽餅粕中存在的硫葡萄糖苷，在芥子酶作用下可生成相應(yīng)的異硫氰酸酯。用水蒸氣后，再用硝酸銀一氫氧化銨溶液吸收，生成相應(yīng)的衍生硫脲。過量的硝酸銀在酸性條件下，以硫酸鐵銨為指示劑用硫氰酸銨回滴，再計(jì)算出異硫氰酸酯的含量。3.2 飼料中嗯唑烷硫酮含量的測定3.2.1原理 飼料中的硫葡萄糖苷被硫葡萄糖苷酶C 芥子酶 水解，再用乙醚萃取生成的曙唑烷硫酮，用紫外分光光度計(jì)測定。3.3

21、 飼料中游離棉酚含量的測定3.3.1 在3-氨基-1-丙醇存在下，用異丙醇與正己烷的混合溶劑提取游離棉酚，用苯胺使棉酚轉(zhuǎn)化為苯胺棉酚，在最大吸收波長440nm 處進(jìn)行比色測定。 具體方法可參見中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB T 13087-19913.3.2測定步驟 (1稱取 12g 試樣<精確到 0.001g，置于 250ml 具塞三角燒瓶中，加入 20 粒玻璃珠，用 移液管準(zhǔn)確加入 50ml 溶劑 A，塞緊瓶塞，放人振蕩器內(nèi)振蕩 1h(每分鐘 120 次左右。用干 燥的定量濾紙過濾，過濾時(shí)在漏斗上加蓋一玻璃片，以減少溶劑揮發(fā)，棄去最初幾滴濾液， 收集濾液于 l00ml 具塞三角燒瓶中。

22、(2用吸量管吸取等最雙份濾液 5lml(每份約含 50100 g 的棉酚分別至 2 個(gè) 25ml 棕色 容量瓶 a 和瓶 b 中。 (3用異丙醇+正己烷混合溶劑稀釋瓶 a 至刻度，搖勻，該溶液用作試樣測定液的參比溶液。 (4用移液管吸取 2 份 10ml 的溶劑 A 分別至 2 個(gè) 25ml 棕色容量瓶 a 和瓶 b 中。 (5用異丙醇十正己烷混合溶劑補(bǔ)充瓶肋至刻度， 搖勻， 該溶液用作空白測定液的參比溶液。 (6加 2ml 苯胺于容量瓶 b 和 bo 中，在沸水浴上加熱 30min 顯色。 (7冷卻至室溫，用異丙醇十正己烷混合溶劑定容，搖勻并靜置 1h。 (8在波長 440nm 處，用分光光

23、度計(jì)以瓶 ao 為參比溶液測定空白測定液瓶 bo 的吸光度，以 瓶 a 為參比溶液測定試樣測定液瓶 b 的吸光度，從試樣測定液的吸光度值中減去空白濁定 液的吸光度值，得到校正吸光度(參見中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) GBT 13086-1991。 3.4 飼料中氰化物含量的測定 3.4.1原理 以氰苷形式存在于植物體內(nèi)的氰北物(hydrocyanic acid經(jīng)水浸泡水解后， 進(jìn)行水蒸氣蒸鎦，蒸出的氫氰酸被堿液吸收。在堿性條件下，以碘化鉀為指示劑，用硝酸 銀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定定量。 3.5 飼料中亞硝酸鹽含量的測定 3.5.1 將樣品在微堿性條件下除去蛋白質(zhì)，在酸性條件下試樣中的亞硝酸鹽與對氨基苯 磺酸反

24、應(yīng)， 生成重氨化合物， 再與氮-1-萘乙二胺鹽酸鹽偶合形成紅色物質(zhì)， 進(jìn)行比色測定。 本研究進(jìn)展論文對飼料中天然有毒有害物質(zhì)的檢驗(yàn)的檢測只是簡單的闡述，由于天 然存在的有毒有害物質(zhì)的檢測手段較普通，檢測效果也比較明顯，所以沒做過多的討論。 本操作步驟摘自于張麗英主編的飼料分析及質(zhì)量檢測技術(shù)第三版271 頁 4 參考文獻(xiàn)： 【1】 王亞噸;林海丹;鄧國東反相高效液相色譜法測定飼料中三聚氰胺含量期刊論文-廣東 飼料 2008(03 【2】Brown C A;Jeong K S;Poppenga R H Outbreaks of renal failure associated with melam

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