菠蘿蛋白酶水解蝦肉蛋白的工藝研究論文定稿

1、. . . . 菠蘿蛋白酶水解蝦肉蛋白的工藝研究摘 要：以水解度作為指標，研究了菠蘿蛋白酶水解蝦肉蛋白的工藝條件，考察了酶解溫度、酶濃度、固液比、時間、pH等因素對蝦肉蛋白酶解的影響。通過正交試驗，確定了菠蘿蛋白酶水解蝦肉蛋白的最適條件為：溫度為45、酶濃度為1.5%、固液比為1:3、時間為5.5h、pH為7左右。在此最佳條件下，蝦肉蛋白的水解度為21.72%。關(guān)鍵詞：蝦肉蛋白;菠蘿蛋白酶;酶解Study On Enzymatic Hydrolysis To Protein From Praw By BromrlainChen Mei（Chemical Sciences and Technol

2、ogy School ,Zhanjiang Normal University，Zhanjiang 524048）Abstract:Using the degree of hydrolysis as target ,prolrlain hydrolysis of protein from praw shrimp was study in this paper.The effects of the main parameters incluling enzymatic temperature,enzymatic dosage,the weight radio of solvent to solu

3、te , enzymatic time and pH on hydrolysis reaction were investigated.On the basis of prthogonal tests,the optimum hydrolysic conditions were determinede.In a word,the suitable hydrolysis conditions were that hydrolysis temperature was45,enzyme dosage1.5%,the ratio of solid to water 1:3,hydrolysis dur

4、ation 5.5 h and pH about 7.Under these conditions,the degree of hydrolysis was 21.72%.Key Words: protein from praw shrimp; prolrlain; hydrolysis0前言多肽是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，由一種或多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成。多肽是構(gòu)成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)片段，也是蛋白質(zhì)發(fā)揮作用的活性基團，是人體進行代、調(diào)控活動的重要物質(zhì)。隨著美國FDA1999年開始允許大豆蛋白制品標注可以預(yù)防心血管疾病的功能和人們對多肽中各氨基酸系列的功效的不斷

5、了解，作為藥物和營養(yǎng)品的多肽產(chǎn)品不斷被開發(fā)出來，多肽的研發(fā)已成為近年生命科學(xué)研究的一大熱點1。目前，多肽的應(yīng)用主要集中在多肽藥物、多肽藥物載體、組織工程材料和多肽營養(yǎng)食品等方面。合成多肽的方法有氨基酸的羧酸酐法、液相分段合成法、組合化學(xué)法、基因工程法、發(fā)酵法、酶解法等。運用酸、堿降解蛋白質(zhì)獲得多肽，固定投資大，周期長，污染嚴重，風(fēng)險大，未能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。用酶解法合成多肽，又稱酶法多肽，就是用生物酶降解蛋白質(zhì)，將動植物大分子蛋白質(zhì)降解成小分子活性多肽。酶解蛋白質(zhì)所用的酶，大多數(shù)是肽酶類。九生堂的鄒遠東教授利用酶解法開發(fā)出大豆多肽、大豆寡肽、鮑魚肽2、海參肽、苦瓜肽3、魚翅肽、燕窩肽等一系列多肽

6、產(chǎn)品，在酶法多肽方面做出了杰出貢獻。酶法多肽具有以下優(yōu)點：酶解不降低蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值，可獲得比原食品蛋白質(zhì)更多的功能；可保持多肽營養(yǎng)純天然綠色屬性，不含任何化學(xué)物質(zhì)等。菠蘿蛋白酶是典型巰基蛋白酶類，是存在于菠蘿植株中的蛋白水解酶系，菠蘿蛋白酶的分子量為33000，能分解蛋白質(zhì)，肽，酯，酰胺。它的水解蛋白的活性比木瓜蛋白酶的活性高十倍以上，因此有著廣泛的用途。它在食品醫(yī)藥等行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用4。它作為一種食品添加劑可用于肉質(zhì)嫩化、啤酒澄清，還用于干酪、明膠、水解蛋白酶的生產(chǎn)。在醫(yī)藥上它可用于生物體溶解纖維蛋白與血凝塊，因此可用于治療水腫與炎癥；它能迅速溶痂，對正常組織無害，不影響植皮，適用于中

7、小面積深度燒傷的治療5。菠蘿蛋白酶在食品工業(yè)中應(yīng)用比較廣泛，但在多肽生產(chǎn)中的應(yīng)用研究較少，因此本論文嘗試用菠蘿蛋白酶水解蝦肉蛋白生產(chǎn)多肽，探索最佳的酶水解條件。1材料和方法1.1原材料菠蘿蛋白酶：酶活力為600GDU, 杰沃利生物制品生產(chǎn)白蝦：購于市南華市場1.2實驗試劑中性甲醛（分析純）;NaOH(分析純);硼酸(分析純);硫酸銅(分析純);硫酸鉀(分析純);混合指示劑（甲基紅乙醇溶液和次甲基藍乙醇溶液）;濃硫酸(分析純)1.3儀器設(shè)備KDN-103F自動定氮儀：纖檢儀器；HYP-1004四孔消化爐：纖檢儀器；H2S-HA04水浴振蕩器：中國市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)；PHS-3C酸度計： 精科冰箱

8、：海爾股份；電動離心機：金壇市新航儀器廠；玻璃儀器氣流燒干器：長城科工貿(mào)易；FA2104N-電子分析天平、電磁爐、蒸鍋等。1.4試驗方法1.4.1氨基態(tài)氮的測定：甲醛滴定法61.4.2蛋白質(zhì)含量的測定：半微量凱式定氮法71.4.3水解度（DH）的計算：DH=酶解液中的含氮量/原料中的含氮量×100%1.5 酶解過程白蝦去頭去殼搗碎于18的冰箱中冷藏稱取適量蝦肉解凍調(diào)好固液比調(diào)適當(dāng)?shù)膒H加入適量的酶量于恒溫水浴鍋震動，酶解一定時間滅酶冷卻至室溫離心分離，取適量上清液于容量瓶定容量取適量稀釋液測其氮含量或蛋白質(zhì)含量。2 結(jié)果與分析在一定溫度、PH 值與底物濃度下，菠蘿蛋白酶能夠分解蛋白質(zhì)

9、生成蛋白胨、 多肽與氨基酸等物質(zhì)。影響酶促水解反應(yīng)的因素很多,例如酶解濃度、固液比、溫度、pH和酶解時間等8-9。即使同一種酶在水解不同底物時，水解條件也不盡一樣。所以應(yīng)首先對酶條件進行單因素分析。2.1酶濃度對酶解效果的影響在固液比為1：3，溫度為45，pH為7，水解時間為2h的條件下進行酶解反應(yīng)，探討菠蘿蛋白酶用量對酶解蝦肉蛋白影響，結(jié)果如圖1。圖1 酶濃度對酶解效果的影響從圖1可見，酶濃度越高，酶解效果越好，酶濃度在1.5%以前，（0.3%2.0%圍，）隨酶濃度的增加，水解度顯著提高。但當(dāng)酶濃度達到2.0%以上時，雖然隨著酶濃度的不斷提高，水解度也有所增加，但增加的幅度相對比較小，因此綜

10、合考慮經(jīng)濟因素，酶濃度不宜過高。所以，確定酶的最適濃度為1.5%左右。2.2固液比對酶解效果的影響在溫度為45，pH為7.0，酶濃度為1.5%，進行酶解反應(yīng)2h，考察固液比對酶解蝦肉蛋白影響，結(jié)果如圖2。圖2 固液比對酶解效果的影響從圖2可知，菠蘿蛋白酶水解蝦肉蛋白，固液比對水解度的影響很大。隨著固液比的增大，水解度呈上升趨勢。但固液比為1:2時，水解度增加非常緩慢，并在固液比1：3時出現(xiàn)最大值?？赡苁窃谠摴桃罕认?，蝦肉蛋白底物可以和蛋白酶充分接觸，并使酶解產(chǎn)物迅速分散，防止了局部產(chǎn)物濃度過高，從而促進了水解反應(yīng)的進行；而后，水分含量繼續(xù)增加，酶的有效濃度與底物濃度均降低，阻礙了水解反應(yīng)的進行

11、。此外，水加入量過大，也會造成熱源的浪費，而且對蝦肉酶解液進一步利用的濃縮環(huán)節(jié)也很不利。綜合考慮，認為固液比為1：3較為適宜。2.3溫度對酶解效果的影響在酶濃度為1.5%，固液比為1:3，pH為7.0左右，酶解時間為2h的條件下，考察酶解溫度對蝦肉蛋白的影響，其結(jié)果見圖3。圖3 溫度對酶解效果的影響圖3結(jié)果表明，溫度對酶的水解反應(yīng)速度影響比較大，溫度較低時，隨著溫度的升高，水解反應(yīng)速度逐漸加快，但伴隨著溫度繼續(xù)升高，在水解速度加快的同時，酶逐漸變性而失去活力，蝦蛋白水解度迅速下降。從圖中可以看出最佳水解溫度在53左右。2.4pH對酶解效果的影響在酶濃度為1.5%，固液比為1:3，水解溫度為53

12、，不同pH中進行酶解2h，考察pH對酶解蝦肉蛋白的影響，其結(jié)果見圖4。圖4 pH對酶解效果的影響由圖4可知，pH為7左右時水解度最大，酶解過程中的pH過高或高低，均會影響菠蘿蛋白酶的活性，從而導(dǎo)致水解度降低。因此，菠蘿蛋白酶酶解蝦肉蛋白的最適pH為7左右，即蝦肉蛋白的原始PH值。2.5時間對酶解效果的影響在酶濃度為1.5%，固液比為1:3，水解溫度為53，pH為7左右的條件下進行酶解，探討酶解時間對水解度的影響。其結(jié)果如圖5圖5 時間對酶解效果的影響由圖5可看出， 酶解時間越長，反應(yīng)越充分，酶解效果越好，酶解時間為5h之前，隨時間增長，水解度顯著提高，但水解時間在5h之后，雖然隨時間的延長水解

13、度也有所增加，但增加的幅度相對較小，因此綜合考慮，酶解的時間確定在5h.2.6正交試驗優(yōu)化酶解工藝條件通過單因素實驗結(jié)果，選擇酶濃度、水解時間、水解溫度、固液比作為正交試驗考察對象，對酶解工藝條件進行優(yōu)化。正交試驗時，酶解液PH值為蝦肉的自然值。因素水平表見表1，正交試驗設(shè)計與實驗結(jié)果見表2表1 實驗方案因素水平溫度/ 時間/h 固液比/% 酶濃度/%1454.51:021.225051:031.53555.51:041.7表2 蝦蛋白酶解正交試驗設(shè)計與結(jié)果分析因素序號溫度(A)時間(B)固液比(C)酶濃度(D)實驗結(jié)果1111117.812122220.653133320.944212319

14、.435223119.376231220.187313218.868321318.999332119.59均值119.80018.70018.99318.923均值219.66019.67019.89019.897均值319.14720.23719.72319.787極差0.6531.5370.8970.974從表2可知，各因素對菠蘿蛋白酶酶解效果影響大小順序為：時間酶濃度固液比溫度。菠蘿蛋白酶的最佳酶解條件為：A1B3C2D2，即酶濃度為1.5%，固液比為1:3，溫度為45，反應(yīng)時間為5.5h。驗證試驗：由于最佳實驗條件沒有出現(xiàn)在正交試驗中，因此要進行驗證性試驗，在該條件下，蝦蛋白酶解測得的

15、水解度為21.72%20.94%（正交里的最大值），說明此正交試驗是成功的，結(jié)果可靠。3結(jié)論通過單因素實驗研究了影響菠蘿蛋白酶水解蝦肉蛋白的各種因素，在此基礎(chǔ)上利用正交試驗對工藝條件進行了優(yōu)化設(shè)計得到了酶解蝦肉蛋白的最佳工藝條件：溫度為45，酶濃度為1.5%，固液比為1:3，pH為7左右，時間為5.5h；蝦蛋白水解度為21.72%。參考文獻1永振，賀繼東，政，希娟.多肽的合成與應(yīng)用進展J.化學(xué)與生物工程,2010,27(4):9-122.鮑魚多肽的制備方法和用途P.CN1 858 221,2006-11-083 鄒遠東.苦瓜多肽的制備方法和用途. CN1 858 223,2006-11-084章佩芬，敏華，郭利平.菠蘿