ELISA的概念原理操作步驟(精)

1、ELISA 是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ）的簡稱卜；它 是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的 ”豐免疫酶技術(shù)。此項技術(shù)自 70 年代初問世 以來，發(fā)展十分迅速，目 可已被廣泛用于 生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許領(lǐng)域。（一）原理ELISA 是以免疫學(xué)反應(yīng)尢基礎(chǔ)，將抗原、牽 9 體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體 一-聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計，

2、具體的方法步 驟可有多種。即：用于檢測抗體的間 接法（圖 a）、用于檢測抗原的雙抗體夾心法（圖 b）以及用 于檢測小分子抗原或 半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA 雙抗體夾心法及 ELISA 間接法。（二）操作步驟方法一用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法：1.包被：用 0.05M PH9.牰碳酸鹽包被 緩沖液將抗體稀釋至 蛋白質(zhì)含量為 110 進(jìn)/ml。在每 L_聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml , 4C過夜。次日，棄去孔內(nèi) 溶液，用洗滌緩沖液洗 3 次，每次 3 分鐘。（簡稱洗滌，下同）。2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml 于上述已包被之反應(yīng)孔中，置 37C孵育 1 小時。然后

3、洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。3.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37C孵育 0.51 小時，洗滌。4.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB 底物溶液 0.1ml , 37C1030分鐘。5.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M 硫酸 0.05ml。6.結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“ +” -“號表示。也可測 OD值：在 ELISA 檢測儀上，于 450nm（若以 ABTS 顯色，則 410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各 孔 OD

4、 值，若匚于規(guī)定的陰性對照 OD 值的 2.1 倍，即為陽性。方法二用于檢測未知抗體的間接法：用包被緩沖液將已知抗原稀釋至110 進(jìn)/ml，每孔加 0.1ml , 4C過夜。次日洗滌 3次。加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml 于上述已包被之反應(yīng)孔中，置 37C孵育 1 小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml，37C孵育 30-60 分鐘，洗滌，最后一遍用 DDW 洗滌。其余步驟同 雙抗體夾心法”的4、5、6。(三)試劑器材1.試劑包被緩沖液(PH9.6 0.05M 碳酸鹽緩沖液):NaCO3匸 59 克 NaHCO32.9

5、3 克 加蒸餾水至 1000ml(2)洗滌緩沖液(PH7.4 PBS) : 0.15MKH2PO40.2 克 Na2HPO412H2O 2.9 克 NaCl 8.0 克 KCl 0.2 克 Tween-20 0.05 % 0.5ml 加蒸餾水至 1000ml(3)稀釋液：牛血清白蛋白(BSA) 0.1 克加洗滌緩沖液至 100ml 或以羊血清、兔血 清等 血清與洗滌液配成 510 %使用。(4)終止液(2M H2SO4):蒸餾水 178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98 % )21.7ml。(5)底物緩沖液(PH5.0 磷酸棗檸檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4 克/ L) 25.7ml0

6、.1M 檸檬酸(19.2 克/ L) 24.3ml 加蒸餾水 50ml。(6)TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液:TMB(10mg /5ml 無水乙醇)0.5ml 底物緩沖液(PH5. 5)10ml0.75%H2O2 32 卩1(7)ABTS 使用液:ABTS 0.5mg 底物緩沖液(PH5.5) 1ml 3 % H2O221(8)抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。(9)正常人血清和陽性對照血清。2.器材：(1)聚苯乙烯 塑料板(簡稱酶標(biāo)板)40 孔或 96 孔，ELISA 檢測儀，501及 1001加樣 器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。(2)小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。(3)4C冰箱，37C孵育箱。(

7、四)注意事項1.正式試驗時，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA 等封閉。2.在 ELISA 中，進(jìn)行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括：(1)固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是 40 孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。（2） 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸

8、附在固相載體表面時，要求純度要好吸附時一般要求 PH 在 9.09.6 之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響，一般多采用 4C1824 小時。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和 10yg/ml 等）進(jìn)行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標(biāo)本的 OD 值。選擇 OD值最大而蛋白量最少的濃度。對于多二；蛋白質(zhì)來說通常為 110yg/ml。（3）酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接 ELISA 法進(jìn)行初步效價的滴定（見酶標(biāo)記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取方陣法”包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。（4）酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體（如 OPD 等）有潛在