鐵促進(jìn)海水小球藻油脂積累的動(dòng)態(tài)過程

1、研究論文AR TICL E鐵促進(jìn)海水小球藻油脂積累的動(dòng)態(tài)過程劉志媛1,2, 王廣策1(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所, 山東青島266071;2. 中國(guó)科學(xué)院研究生院, 北京100039摘要:許多微藻被認(rèn)為是制備生物油燃料的理想原料, 培養(yǎng)液中高濃度的Fe 3+對(duì)海水小球藻(Chlorella vul 2garis 的油脂積累有明顯的促進(jìn)作用。采用熒光分光光度法對(duì)尼羅紅染色后的海水小球藻的油脂積累過程進(jìn)行了觀測(cè), 同時(shí)測(cè)定了鐵對(duì)小球藻生長(zhǎng)和葉綠素含量的影響。結(jié)果表明, 高鐵處理的小球藻出現(xiàn)了兩次油脂積累高峰, 且第2次脂積累的量顯著高于第1次。隨著石油儲(chǔ)量的日益減少和油價(jià)飛漲, 以動(dòng)植注。, 用微

2、藻生產(chǎn)生物柴油具有一定的優(yōu)勢(shì)。首先, 藻類生長(zhǎng)周期短, 生長(zhǎng)速度快, 可以連續(xù)采收, 達(dá)到較高的生物產(chǎn)量和油脂產(chǎn)量。全球石油俱樂部(Global Pet roleum Club 的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明, 微藻油脂的單位面積年產(chǎn)量是油棕的15倍, 大豆的75倍, 油菜籽的200倍3。其次是微藻, 尤其是海水種的, 培養(yǎng)不與農(nóng)業(yè)爭(zhēng)耕地和淡水, 不影響食物安全保障, 如與養(yǎng)殖廢水處理相結(jié)合, 可以充分利用氮、磷等資源, 兼收環(huán)境保護(hù)之利。此外,Scragg 等4的試驗(yàn)結(jié)果表明, 含油量高的小球藻可以直接作為未經(jīng)改裝的內(nèi)燃機(jī)的燃料, 而且產(chǎn)生的SO X 等廢棄污染物較柴油少, 省略油脂提取步驟, 必將提高微藻

3、作為生物柴油原料的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。雖然已有許多培養(yǎng)微藻、制取生物柴油的研究結(jié)果4,611, 但微藻生物柴油至今尚未實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。許多研究微藻制備生物柴油的公司都在致力于降低生產(chǎn)成本。美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL 認(rèn)為, 影響生產(chǎn)成本的關(guān)鍵不是相關(guān)的工程技術(shù)問題, 而主要是微藻的生物質(zhì)產(chǎn)量和油脂含量10。只有當(dāng)油脂含量達(dá)干物質(zhì)的50%60%以上時(shí), 微藻生產(chǎn)生物柴油在價(jià)格上才具有競(jìng)爭(zhēng)力12。作者研究發(fā)現(xiàn), 培養(yǎng)液中高濃度的FeCl 3對(duì)海水小球藻(Chlorell a v ul g aris 的油脂積累有明顯的促進(jìn)作用, 可使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)干質(zhì)量的56. 6%13, 具有潛在的應(yīng)用價(jià)值, 因此作

4、者進(jìn)一步研究了加鐵促進(jìn)這種藻的油脂積累的動(dòng)態(tài)過程以及加鐵對(duì)其生長(zhǎng)的影響。561. 1藻種與培養(yǎng)海水小球藻C. v ul g aris C7由中國(guó)海洋大學(xué)藻種庫(kù)提供。用不加Si 的f/2培養(yǎng)基14(記為f/22Si , 單藻種靜止培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度21±2, 光強(qiáng)為100mol/(m 2s , 光暗比為14h 10h 。海水取自青島匯泉灣, 經(jīng)過濾后煮沸消毒。海水本身Fe 3+濃度為6. 73×10-6mol/L ,f/22Si 培養(yǎng)基初始加Fe 3+(FeCl 36H 2O/EDT A 濃度為1. 2×10-5mol/L 。1. 2分析方法1. 2. 1生長(zhǎng)測(cè)定以小球

5、藻活體吸收光譜500nm 處的光密度值代表細(xì)胞密度, 細(xì)胞數(shù)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。光密度用紫外可見分光光度計(jì)(UV757 測(cè)定。1. 2. 2總脂含量測(cè)定自Greenspan 等15提出用尼羅紅(92diet hyl 2p henoxazine 252one 染色, 用熒amino 25H 2benzo 光法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)油脂含量以來, 先后在多種生物中證明尼羅紅染色后細(xì)胞熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)油脂含量顯著相關(guān)6,1521。作者的研究結(jié)果表明, 經(jīng)尼羅紅染色后的小球藻在480nm 光激發(fā)下, 位于580nm 的熒光峰的強(qiáng)度與稱質(zhì)量法測(cè)定的總脂含量呈線性收稿日期:2008203210; 修回日期:200820

6、4225基金項(xiàng)目:國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA05Z112, 2007AA09Z110,2007AA09Z406gcwang ms.qdio. ac. cn海洋科學(xué)/2008年/第32卷/第11期研究論文AR TICL E正相關(guān)13。因此, 本實(shí)驗(yàn)采用同樣熒光分光光度法直接測(cè)定細(xì)胞的中性脂含量, 具體方法為:1mL 藻液加0. 01mL 尼羅紅染料(質(zhì)量濃度為0. 1g/L 丙酮 染色7min 后, 用日立F 24500型熒光分光光度計(jì), 用480nm 光激發(fā), 測(cè)定熒光發(fā)射光譜, 以波長(zhǎng)為580nm 的熒光強(qiáng)度減去藻細(xì)胞和尼羅紅在該波長(zhǎng)處的熒光值, 所得相對(duì)熒光強(qiáng)度與細(xì)胞中總脂含量呈線性

7、關(guān)系。1. 2. 3葉綠素含量測(cè)定80%丙酮:二甲基亞砜溶液(體積比1/1, 提取葉綠素, 用UV757分光光度計(jì)測(cè)定663nm 和645nm 光密度22,Arnon 公式計(jì)算抽提液中的葉綠素含量23。1. 2. 4統(tǒng)計(jì)分析對(duì)3次平行試驗(yàn)結(jié)果, 用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析24。用尼羅紅染色法可以不經(jīng)抽提, 直接測(cè)定藻類細(xì)胞中的脂含量, 而所需材料少, 使分析測(cè)定方法明顯簡(jiǎn)化。2結(jié)果2. 1nm 光激發(fā)時(shí)的室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜如圖1所示。位于690nm 的是葉綠素a 的發(fā)射峰, 位于580nm 的是被尼羅紅染色的脂的發(fā)射峰, 由于二者相距約100nm , 葉綠素不會(huì)影響細(xì)胞中脂含量的直接測(cè)定

8、。在普通培養(yǎng)條件下(f/2培養(yǎng)基 , 已達(dá)生長(zhǎng)靜止期的小球藻沒有油脂積累(曲線a , 向處于指數(shù)生長(zhǎng)后期的培養(yǎng)液中補(bǔ)加2. 4×10-5mol /L Fe 3+(FeCl 36H 2O/ED TA 后,580nm 處出現(xiàn)平緩的熒光峰, 說明油脂含量增加(曲線b 。如將處于指數(shù)生長(zhǎng)后期的小球藻離心收集并重新懸浮于補(bǔ)加1. 2×10-5mol/L Fe 3+的f/22Si 培養(yǎng)基中,580nm 熒光發(fā)射峰升高并超過葉綠素?zé)晒夥? 說明小球藻重新接種于新的含較高Fe 3+濃度的培養(yǎng)基中后, 能夠大量積累油脂(曲線c 。nm 1emission spectra of Nile re

9、d 2stained C.vul garis cells with 480nm as the excitation wavelength 曲線a :普通培養(yǎng)條件下的小球藻的熒光發(fā)射光譜; 曲線b :指數(shù)生長(zhǎng)后期補(bǔ)鐵的小球藻的熒光發(fā)射光譜; 曲線c :重新接種于高鐵培養(yǎng)基中的小球藻的熒光發(fā)射光譜Curve a :emission spectrum of C. v ul garis under ordinary growt h conditions ; curve b :emission spectrum of C. v ul garis supplemented wit h Fe 3+in t

10、he later exponential growt h phase ; curve c :emission spectrum of C. vul garis reinoculated into medium wit h high Fe 3+con 2centration2. 2小球藻生長(zhǎng)和脂積累的動(dòng)態(tài)過程處于指數(shù)生長(zhǎng)后期的小球藻經(jīng)4000g 離心5min 后, 細(xì)胞沉淀重懸于不加鐵的f/22Si 培養(yǎng)液中, 用分光光度法測(cè)定生長(zhǎng)和油脂積累的動(dòng)態(tài)過程, 結(jié)果如圖2所示。圖2培養(yǎng)基中添加不同濃度的Fe 3+對(duì)小球藻(C. v ul garis 生長(zhǎng)(a 和油脂積累(b 的影響Fig. 2Grow

11、th and lipid accumulation of C. vul garis in media supplemented with different levels of Fe 3+concentrationMarine Sciences/Vol. 32,No. 11/200857研究論文AR TICL E由圖2可知, 重新懸浮于不加鐵的新f/22Si 培養(yǎng)基中, 小球藻仍可以利用海水中的鐵(Fe 3+濃度為6. 73×10-6mol/L 恢復(fù)生長(zhǎng), 但指數(shù)生長(zhǎng)期較短。添加1. 2×10-6mol /L Fe 3+, 則指數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng), 達(dá)到較高的細(xì)胞密度, 說明適當(dāng)

12、提高海水中鐵的濃度, 可以促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng), 但是對(duì)油脂的積累無明顯的促進(jìn)作用。當(dāng)添加的Fe 3+濃度提高10倍, 達(dá)到1. 2×10-5mol/L 時(shí), 在第9天至第13天時(shí), 小球藻細(xì)胞數(shù)增加很慢, 以后又恢復(fù), 最后細(xì)胞密度與不加Fe 3+的處理相近, 說明鐵濃度過高對(duì)生長(zhǎng)有抑制作用, 但并不十分嚴(yán)重。另一方面, 添加高濃度的Fe 3+(1. 2×10-5mol/L 對(duì)脂的積累可產(chǎn)生顯著的影響, 在加鐵后的第6天和第17天分別出現(xiàn)油脂積累的高峰, 油脂含量分別為其他處理的3倍和7倍。而且, 兩個(gè)高峰之間油脂含量的最低點(diǎn)恰好是細(xì)胞分裂的延緩期(加鐵后的第9天至第11天

13、。因此, 油脂積累的第一個(gè)高峰相當(dāng)于細(xì)胞對(duì)逆境的響應(yīng)積累不僅時(shí)間長(zhǎng), , 步, 3討論加鐵使含油量不高的小球藻的脂含量提高了7倍, 高達(dá)干物質(zhì)質(zhì)量的50%以上, 這對(duì)于生物柴油開發(fā)具有一定的吸引力, 特別是海水小球藻可以用海水培養(yǎng), 不與農(nóng)業(yè)爭(zhēng)水源和耕地, 更具有明顯的優(yōu)勢(shì)。包括小球藻在內(nèi)的多數(shù)綠藻的貯藏物質(zhì)是淀粉, 在葉綠體中以淀粉粒形式存在, 當(dāng)遇到逆境時(shí)有些綠藻會(huì)大量積累油脂5,25。在小球藻中觀察到的這種油脂大量積累現(xiàn)象, 可能是由于已糖庫(kù)的代謝途徑由合成淀粉為主轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣捎椭? 分叉點(diǎn)在于磷酸已糖的調(diào)用方向。光合作用所固定的過量的碳進(jìn)入磷酸已糖庫(kù), 一方面, 另一方面, 還可通過是脂

14、肪酸合成的前, , 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上同甘油232磷酸形成中性脂三酰甘油, 貯存于油體中26, 這就是被尼羅紅染色后, 經(jīng)熒光檢測(cè)觀察到的油脂積累現(xiàn)象。磷酸已糖如被調(diào)用作脂肪酸合成, 淀粉的合成將受到抑制。乙酰輔酶A 還是線粒體中的三羧酸循環(huán)的碳源, 其中間產(chǎn)物琥珀酰輔酶A 是合成卟啉類化合物的基本原料, 而卟啉是合成葉綠素、細(xì)胞色27素及藻膽素的基本原料。因此, 在實(shí)驗(yàn)中觀察到的油脂積累和葉綠素含量的變化是葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等多種細(xì)胞器協(xié)同作用的結(jié)果。但是在這些代謝途徑中并沒有鐵的直接作用位點(diǎn)。葉綠體是微藻細(xì)胞的主要鐵庫(kù), 一條完整的光合電子傳遞鏈需要24個(gè)鐵原子。此外, 線粒體的呼吸電子傳遞鏈

15、中的細(xì)胞色素也是鐵卟啉化合物, 葉綠體、線粒體的電子傳遞鏈和光合作用、呼吸作用等基礎(chǔ)代謝過程是鐵的直接作用位點(diǎn)。在大洋中, 存在著高氮、低葉綠素含量的初級(jí)生產(chǎn)力極低的區(qū)域, 其限制因子就是海水中可利用鐵的含量低于臨界濃度, 通過補(bǔ)鐵可以明顯提高初級(jí)生產(chǎn)力28。在光能自養(yǎng)的小球藻中, 光合作用和呼吸作用在具有超循環(huán)結(jié)構(gòu)的代謝網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位, 以正反饋的方式驅(qū)動(dòng)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)運(yùn)轉(zhuǎn), 鐵通過影響光合作用和呼吸作用, 如何進(jìn)一步影響糖庫(kù)的調(diào)用方向, 由貯存淀粉轉(zhuǎn)向積累油脂是需要進(jìn)一步研究的問題。顯然, 這些過程涉及到葉綠體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等多種細(xì)胞器的協(xié)同作用, 由于乙酰輔酶A 在脂肪酸合成和呼吸作用中

16、處于代謝的關(guān)鍵位置, 同時(shí)又是脂類2氧化的產(chǎn)物, 在這種協(xié)同作用中乙酰輔酶A 的代謝趨向和調(diào)控是值得關(guān)注的問題。2. 3在加鐵后重新培養(yǎng)7,11,19d 時(shí)測(cè)定小球藻葉綠素a 和b 的含量(圖3 。在不添加鐵, 只能利用培養(yǎng)液海水中鐵的情況下, 葉綠素含量較低, 除第19天葉綠素b 的含量稍下降外, 葉綠素a 和b 的含量在培養(yǎng)期間無明顯變化。加鐵培養(yǎng)基中小球藻的葉綠素含量均高于不加鐵的。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng), 加鐵量高的影響更明顯(如第11天和第19天 。此外, 在加Fe 3+濃度為1. 2×10-5m ol/L 時(shí), 葉綠素a 和b 的含量均以第11天為最高, 恰好與細(xì)胞生長(zhǎng)減緩和油脂

17、含量下降至最低點(diǎn)同步(圖2, 圖3 。圖3培養(yǎng)基中添加Fe 3+對(duì)小球藻(C. vul garis 葉綠素a 和葉綠素b 含量的影響Fig. 3Chlorophyll a and b contents of C. vul garis in mediasupplemented Fe 3+58海洋科學(xué)/2008年/第32卷/第11期研究論文AR TICL Egrowth and lipid accumulation in Chlorella vul garis J.Bioresour T echnol , 2008, 99:471724722.14Guillard R R , Ryther J H

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