重組豬生長激素表達研究進展_圖文

1、生物技術進展年 第 卷 第 期 進展評述Reviews 收稿日期 ：；接受日期 ： 基金項目 ：云南省現代農業(yè)蠶桑產業(yè)技術體系項目 （）；現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項 （）資助 作者簡介 ：張永紅 ，研究實習員 ，碩士研究生 ，主要從事家蠶病理研究 ： 通信作者 ：白興榮 ，副研究員 ，主要從事家蠶遺傳育種和家蠶病原微生物病理研究 ：重組豬生長激素表達研究進展張永紅 ， 唐芬芬 ， 邵榆嵐 ， 鐘 健 ， 白興榮 云南省農業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所 ，云南 蒙自 摘 要 ：豬生長激素作為豬生長發(fā)育過程中起主導作用的蛋白質激素 ，能增加肌肉組織蛋白含量 降低脂肪含量 促進 骨骼發(fā)育 刺激乳汁分泌等

2、，是畜牧養(yǎng)殖業(yè)中值得開發(fā)利用的激素之一 利用基因工程技術生產重組豬生長激素使豬生 長激素在生產上應用成為可能 本文簡要介紹了豬生長激素 ，總結了重組豬生長激素表達的研究進展 ，并展望了重組豬 生長激素的應用與發(fā)展前景 關鍵詞 ：豬生長激素 ；生理功能 ；重組表達 ；展望 ：，：（）， ， ，：； 豬生長激素 （，）是豬腦垂體前葉嗜酸性 細胞分泌的一種單一肽鏈蛋白質激素 ，在調節(jié)豬 的生長發(fā)育方面起著重要作用 ，主要表現在降低 脂肪含量 促進蛋白質合成和增加動物泌乳量 ，是 畜牧業(yè)生產中極其重要的激素之一 隨著人 類日益增長的消費需求 ，利用基因工程技術表達 豬生長激素應用于養(yǎng)豬業(yè) ，可提高豬生

3、長速度 緩 解養(yǎng)殖產業(yè)的壓力 滿足消費市場對豬肉的需求 ，產生重大的經濟效益 本文主要綜述了豬生長激 素的基因結構 生理功能及其重組蛋白表達研究 的進展 ，并展望了重組豬生長激素的應用和發(fā)展 前景 豬生長激素的概述豬生長激素是一類多肽類激素 ，由 個氨 基酸組成 ，分子量 ，等電點為 豬基因組 中 基因為單拷貝 ，且無其他相似序列 ，其基因 全長為 ，由 個外顯子和 個內含子構 成 ，其外顯子長度分別是 和 ，內 含 子 長 度 分 別 為 和 ；編碼成熟肽的片段大小 為 作為動物生長發(fā)育關鍵的激素 ，其基因序列在各物種中高度保守 ，與人 （）牛 （）鼠 （）生長激素的核苷酸序列具有 高度同源

4、性 同 基因的 端 端 及 下游序列高度保守 ，據此說明它們可能 以某種相同的方式來調節(jié) 的合成 ，可推測 作為代謝關鍵激素在物種進化過程中基因序列仍 然高度保守 蛋白的三維結構已經獲得解 析 （圖 ），射線晶體結構分析表明 ，與 （圖 ）極為相似的是都含有 個 螺旋 圖 的蛋白質結構 ，蛋白質結構 ；蛋白質結構豬生長激素的生理功能生長激素是脊椎動物腦垂體分泌的多肽類激 素 ，是動物調節(jié)生長和組織發(fā)育必不可少的激素 ，缺乏該激素機體就會停止生長 ，它與下丘腦分泌 的促生長激素釋放因子 抑制素 類胰島素樣生長 因子和胰島素等體內激素形成刺激和反饋機制 ，共同影響動物各類型組織的生理代謝 豬生長激

5、 素生理功能主要表現在以下幾個方面 降低脂肪含量能使豬背膘的厚度和胴體脂肪含量明 顯降低 注射 能減弱脂肪合成 抑制脂肪 合成酶活性 ，直接作用于脂代謝中關鍵酶乙酰輔 酶 使其活性和 含量分別下降 和 提高蛋白質合成量生長激素通過增加氮存留 氨基酸吸收 蛋白 質合成的氨基酸摻入 ，以及作用于 聚合酶 ，調節(jié)轉錄來促進蛋白質合成 注射 以后 ，豬 胴體品質有很大變化 ，表現為組織蛋白含量增加 ，瘦肉率提高 與抗胰島素表現為拮抗效應 ，葡萄糖需求減少 ，進而合成更多的蛋白質 它能 調節(jié)葡萄糖和游離脂肪酸兩種關鍵代謝物不可逆 轉的流失和氧化 ，短時間內提高乳汁分泌量 ，也可 減少氮流失而提高蛋白質合

6、成率 對類胰島素樣生長因子 胰島素分泌及葡萄 糖濃度的影響等 研究發(fā)現 ，注射 能使豬血清 中類胰島素樣生長因子 和胰島素的水平 提高 ，而且血漿中葡萄 糖 含 量 明 顯 提 高 重 組 蛋白注射到動物體內能加快本體生長激素 和 循環(huán)水平 ，促進肝臟中 水平 升高 對不同生長階段豬個體的影響長期注射豬生長激素對哺乳仔豬 （到第 斷奶的哺乳豬 ） 小豬 （體重 左右 ） 生 長豬 后備母豬 和哺乳母豬都能明顯提高 體重 ，而且哺乳母豬泌乳量也有較大提高 對礦物質代謝的影響能促進鈣 磷 鎂等礦物質元素的吸收 ，但礦物質元素在血漿中的濃度不發(fā)生變化 等 發(fā)現 可增強 元素在體內的 滯留 ，并促進其

7、吸收 重組豬生長激素的表達最早是直接從豬腦組織中提取獲得 ，而 采用簡單的化學方法從豬垂體中提取 ，大量 豬個體腦垂體只能得到微量 ，存在回收量和 回收率低等問題 ，極大限制了 的應用 借助 基因工程技術表達 能夠克服上述缺點 ，使生物技術進展 在生產上應用成為可能 自 世紀 年代起 ，有關 的克隆研究 逐步深入 等 用基因文庫的方法克隆 了 的 非 全 長 基 因 ；繼 而 ，等 利 用 含 基因全長 序列作為雜交探針確定了該 基因的全序列 我國在國外 研究的基礎上 ，也進行了一些探索 王華巖等 克隆得到了含 端和 端 的 全長 ；齊順章等 對 全基因序列進行了測定分析 ；楊青 等 從構 建

8、 的 豬 腦 垂 體 基 因 文 庫 中 篩 選 到 了 基因并成功克隆了該基因 等 最 先通過原核表達技術表達豬生長激素 ，而且具有 促生長生物活性 目前的研究集中在利用原核或 真核表達系統(tǒng)高效表達有活性的重組 上 基因的原核表達原核生物表達系統(tǒng)通常以大腸桿菌作 為受體 ，技術成熟 操作簡便 ，且大腸桿菌繁殖周 期短 外源蛋白表達量高 但原核表達系統(tǒng)也存 在明顯缺點限制其應用 ，主要體現在 ：原核其表 達的 形成會包涵體 ，而不能分泌到培養(yǎng)基上 清中 ，提取蛋白質首先必須首先破碎細胞獲得包 涵體 ，然后利用強變性劑來溶解包涵體使 蛋 白變性 ，最后變性蛋白通過復性才能得到活性蛋 白 ，包涵體

9、雖有益于抵御蛋白酶降解 ，但不利于蛋 白質的分離純化 原核表達蛋白無翻譯后的修 飾 ，并且從包涵體制備的外源蛋白可能無生物活 性 ，基因的表達序列長度 （序列 成熟肽 片段等 ）也影響蛋白質的活性 原核重組表達 系統(tǒng)遺傳穩(wěn)定性差 ，需要選擇合適的表達載體來 表達目的蛋白質 ，還需優(yōu)化誘導溫度 誘導因子 等 解決上述問題 ，原核表達 才 能 成 功 應 用 最新研究證實 ，注射原核表達的重組 蛋 白的日本微型豬表現出促生長效果 基因的真核表達哺乳動物細胞表達 在哺乳動 物 魚類中已經成功得到表達并具有生物效應 ，考 慮到哺乳動物細胞表達的產物在分子結構 理化 特性和生物學功能方面最接近天然蛋白質

10、分子 ，用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)來表達 ，可為 蛋白的生產應用提供依據 脂質體載體和病毒載體常用于哺乳動物細胞 的轉 染 年 ，等 利 用 哺 乳 動 物 猴 細胞成功表達了 ，重組 蛋白同天 然 蛋 白 分 子 大 小 一 致 年 ，等 發(fā)現陽離子脂質體 （）能克服細胞障礙 將表達載體成功轉染到細胞內表達目的基因 年 ，等 利用 介導的含 基因 載體在 真核細胞內表達 蛋白和小鼠 體內表達 ，小鼠體重發(fā)生顯著變化 陳斌方 等 用帶有 的核糖體進入位點介導 的雙順反子并帶有新霉素抗性標記的逆轉錄病毒 載體 轉染鼠胚胎成纖維細胞 ，將感染的 細胞通過腹膜注射到同系的去垂體小鼠體內 ，發(fā) 現感染細胞

11、分泌表達的 具有生物活性 ，植入 后小鼠脛骨有明顯的促生長效應 ；處理小鼠發(fā)現植入的成纖維細胞 還有存留 ，隨著小鼠生長 ，轉染細胞減少而 水平 降低 ，但 轉錄水平并不降低 采用病毒載體 轉染細胞植入動物體內能夠表達有促生長效應的 活性蛋白 ，但表達水平受 拷貝數的限 制 利用不帶任何篩選標記的逆轉錄病毒載體將 轉入鼠成纖維細胞 中表達 ，并 將帶有新霉素篩選標記的 反病毒載體二次 感染處理 細胞 ，結果發(fā)現增加宿主染色 體前病毒中 的拷貝數增加 ，進而增加 氮端發(fā)生修飾的 的分泌量也有所增加 利用哺乳動物細胞系來表達 ，表達的重 組蛋白具有翻譯后的修飾并表現天然的生物活 性 ，但應用何種哺

12、乳動物細胞系表達都存在細胞 凋亡 表達調控原件的優(yōu)化等問題 ，細胞培養(yǎng)成本 較高并且篩選標記不明顯 ，加之目的蛋白收獲量 較低 ，很難投入生產 ，因此需要探索新的蛋白質表 達技術 酵母表達 酵母表達的外源蛋白存 在翻譯后的加工修飾 ，酵母兼具大腸桿菌異源蛋 白表達量高的優(yōu)點 ，因此酵母已成為基因工程技 術中重 要 的 表 達 系 統(tǒng) 等 根 據 已 報 道 的 基因編碼序列 ，通過優(yōu)化密碼子在酵母細胞 中成功表達了 ，其大小為 ，并占胞內 可溶蛋白 ，獲得的重組 同樣具有改變豬 生長速率的生物活性 但是酵母表達系統(tǒng)同樣存 在表達蛋白內部降解 信號肽加工不完全 表達產 物過度糖基化等不足 ，需要

13、在實際應用中不斷 改進 昆蟲表達 桿狀病毒表達載體系統(tǒng) 張永紅 ，等 ：重組豬生長激素表達研究進展（，），也稱 作昆蟲表達系統(tǒng) ，于 世紀 年代構建并開始 廣泛應用 ，是一種功能全面的真核細胞基因表達 載體系統(tǒng) ，具有多角體啟動子控制下的高效表達 真核細胞完善的轉譯后加工修飾 較易從細胞培 養(yǎng)上清中和昆蟲組織中純化目的蛋白等優(yōu)點 當前 ，已有數千計的異源基因在該系統(tǒng)中得 到表達 ，且產生的重組蛋白可進行精確的蛋白質 折疊 糖基化 信號肽切割等翻譯后加工修飾 ；并 且基因加入信號肽后 ，表達產物有較強的胞外分 泌能力 ，有利于產物的后加工 ，并且重組體的遺傳 穩(wěn)定性好 ，在上述方面明顯優(yōu)于原核表

14、 達載體系統(tǒng) 歐陽菁等 利用 在昆蟲細 胞中表達了 基因 ，選擇帶病毒 基因啟動 子和 信號肽的重組 轉移載體 ，與致死缺陷型線性化 共轉染 草地夜蛾細胞 （），構建了既能形成多角體又能 表達外源基因的苜蓿丫紋夜蛾核多角體重組病毒 ，和 雜交檢測到感染重組病毒的 細胞上清液可溶 蛋白中 的豬生長激素條帶 ，蛋白占細 胞可溶蛋白的 雖然桿狀病毒表達系統(tǒng)表 達蛋白可完成翻譯后的修飾并且表達量相對較 高 ，但該系統(tǒng)還具有病毒增殖周期較短 ，目的蛋白 無法連續(xù)表達的缺點 ，并且病毒基因表達調控機 制尚不清楚 ，各病毒株系之間毒力還存在差異 ，毒 力的大小和增殖直接影響蛋白質的表達量 ，需要 進一步深入

15、研究 家蠶是迄今為止被人類完全馴化并得以充分 利用的重要經濟昆蟲之一 ，具有易飼養(yǎng) 繁殖周期 短 繁殖數量大等特點 在基因工程領域 ，作為重 要的模式生物 ，家蠶的遺傳背景清楚 ，研究深入 家蠶表達外源基因具有簡單 成本低廉 安全等優(yōu) 點 ，以家蠶生物作為反應器可低成本 大規(guī)模生產 重組蛋白 ，是一種重要的昆蟲表達系統(tǒng) ，目前已得 到廣泛的開發(fā)與應用 家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)被 廣泛用于家蠶生物反應器研究中 ，朱江等 將帶 有 純 化 標 簽 的 基 因 片 段 連 接 到 構建成重組穿梭載體 ，重組 載體同 共轉染 細胞 ，細胞破碎 后的上清溶液中可檢測到 蛋白表達 ；細胞上清液接種 齡家蠶和蠶

16、蛹 ，幼蟲和蛹血淋 巴中均檢測到分子量約 的特異 蛋白 質條帶 ，證實 在家蠶細胞和蠶體中得到了表 達 與昆蟲培養(yǎng)細胞相比 ，利用家蠶幼蟲和蛹生 產 能夠獲得更高的表達量 ，同時還可開發(fā)為 含有 蛋白的新型昆蟲飼料 利用家 蠶 表 達 系 統(tǒng) 生 產 重 組 蛋 白 時 ，存在家蠶批次病毒接種的問題 ，并且后續(xù)蛋白 分離純化相對繁瑣 因此 ，對家蠶反應器表達重 組蛋白的大量研究集中在改進轉基因方法 ，以及 如何提高蛋白表達量和易于分離純化蛋白上 家 蠶個體表達重組蛋白 的后續(xù)分離純化較為 困難 ，而采用家蠶特異組織 （絲腺 脂肪體等 ）在 特定時期表達 ，可提高其表達量并彌補個體 表達的不足

17、家蠶幼蟲的絲腺作為合成和分泌絲 蛋白的器官 ，齡后期絲膠和絲心蛋白大量合成 ，若利用相應的絲膠和絲素啟動子來驅動 的 表達 ，不僅利于純化目的蛋白 ，而且表達量大為提 高 家蠶組織特異性表達基因的啟動子也逐 漸被克隆 ，如 蛋白家族中的 基因啟動子 ，在家蠶脂肪體和血液中特異表達 ，還有中腸特 異表達 啟 動 子 等 而 家 蠶 組 成 型 啟 動 子 如 熱激蛋白 啟動子 在家蠶的各個組 織盡有表達 ，不存在時期特異性 ，應用這類啟動子 則方便純化蛋白且目的蛋白表達量也相對較高 為了增強啟動子的驅動活性 ，也可以在啟動子的 上游插入增強子片段使目的蛋白表達量增大 目 前家蠶轉基因技術相對成熟

18、 ，已經建立各種轉基 因載體 ，如 ，基于 轉座子帶熒光篩選標記 （）的轉基因家蠶 ，制作相對容易 家蠶轉基因技術的研究對拓展家蠶生物反應器和 促進 的生產化具有重要意義 轉基因動物研究自 年將 基因整合到小鼠基因組上 首先實現陽性轉基因小鼠 ，利用轉基因技術已 經成功將 基因應用于豬 兔子 等哺乳 動物 評估重組 的功能需要測定轉基因動 物體重和組織發(fā)育情況 ，確定 的促生長作 用 年 ，等 建立用人金屬硫蛋白啟 動子驅動 表達的轉基因豬 ，陽性個體較陰性 個體生長速率加快和體重有所增加 ；年 ，仲 飛等 同樣使用綿羊鐵硫蛋白啟動子啟動 在小鼠體內表達促進了個體生長速率 實驗動物 體重發(fā)生了

19、明顯變化 ，但是潛在的風險還不得而 知 ，為了克服簡單外源啟動子驅動 表達的轉生物技術進展 基因技術給動物個體產生的副作用 ，等 運 用 （細菌人工染色體 ）攜帶 基因 ，還包 括正 負調控元件 ，選擇合適啟動子驅動 在 小鼠體內表達 ，陽性小鼠在整個發(fā)育過程中未發(fā) 現任何疾病癥狀 年 ，張志紅等 構建綿 羊鐵硫蛋白啟動子啟動 的表達盒 ，將載體注 射到金魚受精卵內表達 ，金魚表達的重組 能使其體重明顯上升 ，證實 在魚類也同 樣產生促生長的效果 4 重組豬生長激素的應用與發(fā)展前景開發(fā)重組豬生長激素具有重要的科研價值 經濟意義 社會意義和生態(tài)效益 動物微量注射 就能產生明顯的促生長效果 ，能夠

20、提高豬對 飼料的利用率 ，縮短肉豬的出欄時間 ，減少碳排 放 ，緩解市場供需矛盾 但 的應用必須有嚴 格的規(guī)范和監(jiān)管 ，一方面 ，過量注射或長期注射 會產生風險 ，甚至嚴重的副作用 ，如雌性牛 個體生育率下降 ，可能完全不育 ，免疫力也低于未 注射的個體 ，而豬長期注射重組 蛋白的 潛在問題還未評估 另一方面 ，由于正常動物個 體自身合成分泌的生長激素足以維持正常的生長 發(fā)育 ，因此利用通過轉基因技術在動物體內過量 表達同源或外源 進行生產性應用 ，則必須嚴 格評估其安全性 使用重組 促進肉豬生長的同時保持豬 個體的健康是今后生產應用的重要方向 重組 蛋白與固醇類激素 人工合成的生長調節(jié)激 素

21、不同 ，不會長時間在動物體內殘留 ，因此不存在 在動物體內積累的問題 人食用注射 的豬或轉 基因的豬 ，因 半衰期較短 種 間異性 ，不與 受體結合產生生理效應 ，短時 間內對人體不會產生危害 ，但是目前還沒有充分 的證據證明 對人體無潛在且長遠的影響 ，因 此還需嚴格評估 盡管重組 應用于養(yǎng)豬業(yè) 仍存在分歧 ，但是相對于傳統(tǒng)生長調節(jié)激素 ，在動 物毒性 動物殘留和對人體的影響等方面 ，已經具 有明顯的比較優(yōu)勢 通過基因工程技術優(yōu)化 ，清 楚探索該激素作用機制 ，重組豬生長激素同樣能 夠應用于生產 通過優(yōu)化 基因的翻譯序列 引入其基因內含子序列 選擇優(yōu)異的啟動子等手 段使得重組 蛋白更接近天然

22、結構 ；清楚了解 的代謝機理 ，研究如何在生豬飼養(yǎng)過程中合 理 規(guī)范使用 蛋白 ，可將 蛋白質運用于 養(yǎng)豬業(yè)以生產更加健康的豬 不同區(qū)域的豬在瘦 肉率 口感 生長速度等性狀上都存在差異 ，運用 傳統(tǒng)的育種手段 ，還存在生殖隔離 選育周期較長 等問題 ，若將 用于經濟性狀較好的豬品種 ，該品種豬可實現瘦肉率高 生長較快等傳統(tǒng)育種 的目標 ，可解決傳統(tǒng)遺傳育種遇到的上述問題 利用經濟昆蟲家蠶來表達豬生長激素 ，可充 分合理利用家蠶資源 ，繭殼產生其經濟價值外 ，蛹 和蛾還可以開發(fā)含 的新型飼料添加劑 ，無 需提取純化 蛋白即可直接應用 ，節(jié)省 蛋白的生產成本 ，這也是目前頗具生產前景的研 究方向

23、隨著人口增加 ，人們對物質生活要求的提高 ，養(yǎng)豬業(yè) 飼 料 成 本 上 漲 占 生 產 成 本 比 重 增 大 ，的使用有助于緩解上述矛盾 重組 蛋 白質并不隨著豬的生長在豬體內殘留 ，在經基因 工程技術優(yōu)化以后 ，能為廣大消費者提供相 對廉價 瘦肉率高 更健康的豬 ，產生重大的社會 效益 ，因此 ，研究開發(fā)重組豬生長激素 實現重組 豬生長激素蛋白生產化具有廣闊的發(fā)展前景 參 考 文 獻，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，張永紅 ，等 ：重組豬生長激素表達研究進展 ， ， （） ： ， ， ， ， （） ： ， ， ， ， ， （） ： ， ， ， ： ， ， ， （ ） ： ， ， ， ， （） ： 汪琳仙， 張少英 外源豬生長激素對豬血液葡萄糖、 胰島素 含量的影 響 北 京 農 業(yè) 大 學 學 報， ， （ ） ： 生物技術進展 ， ， （ ） ： ， ， ， ， ， （） ： ， ， ，