脂質體電動色譜法評價阿魏酸與生物膜的相互作用

1、脂質體電動色譜法評價阿魏酸與生物膜的相互作用        【摘要】     利用脂質體與生物膜結構的相似性，將脂質體加入毛細管電泳緩沖溶液中作為假固定相，在數(shù)分鐘內測定了阿魏酸的脂水分配系數(shù)Klw，建立了脂質體電動色譜評價阿魏酸與生物膜相互作用的方法。研究了脂質體中膽固醇的含量、緩沖溶液pH值和緩沖體系對Klw的影響。結果表明，在實驗條件范圍內（膽固醇含量030%，pH值4.012.0），膽固醇含量升高，緩沖溶液pH值增大，Klw降低；在不同的緩沖體系中，離子強度

2、越大，Klw越大。脂水分配系數(shù)的變化反映了阿魏酸與生物膜相互作用。     【關鍵詞】  脂質體電動色譜 阿魏酸 生物膜 脂水分配系數(shù)    1  引言    藥物與生物膜的相互作用在定量結構活性關系（quantitative structure activity relationship，QSAR）中應用廣泛，已成為一個重要的研究領域1。而脂質體是一種合適的生物膜模型，藥物在脂質體相和水相的分配系數(shù)（Klw）可作為評價藥物膜相互作用的尺度，提供某種藥物透過生物膜難

3、易程度的信息25。傳統(tǒng)測定Klw方法較繁瑣、耗時，且需要高純度和大體積的樣品。    脂質體電動色譜（LEKC）61結合了脂質體同生物膜結構的相似性和毛細管電泳的快速高效性，在研究藥物與生物膜相互作用中表現(xiàn)出了巨大的優(yōu)勢。如簡便、快速、自動化和微量。應用LEKC測定Klw僅需幾分鐘，而傳統(tǒng)方法需幾小時甚至幾天。Zhang等首先嘗試用LEKC分析藥物與生物膜相互作用。Burns建立了線形溶解能關系式（linear solvation energy relationship， LSER），揭示了各種不同類型的作用力對藥物進入脂質體的貢獻。Carrozzino，研究了緩

4、沖液pH值及緩沖體系對堿性藥物Klw的影響。而酸性藥物阿魏酸Klw的測定及影響因素尚未見報道。本研究采用LEKC方法快速測定了阿魏酸的Klw，同時考察了脂質體中膽固醇的含量，緩沖溶液的pH值和緩沖體系對阿魏酸Klw的影響。2  實驗部分2.1  儀器與試劑    P/ACETM MDQ 型高效毛細管電泳系統(tǒng)(Beckman Coulter，USA)， 配有二極管陣列檢測器(DAD) 及儀器操作和數(shù)據(jù)采集軟件(32 Karat Software)；未涂敷熔融石英毛細管， 60 cm (有效長度50 cm)×50 m i.d. (河北永年

5、光導纖維廠)；pHS25型酸度計(上海虹益儀器儀表有限公司)。阿魏酸(Sigma 公司)； 膽固醇（北京奧博星生物技術有限公司）；卵磷脂（serva 公司）；所用水為二次蒸餾水；其它試劑均為分析純； 0.45 m微孔濾膜（上海新亞凈化儀器廠）。2.2  脂質體的制備    稱取一定量卵磷脂和膽固醇于50 mL圓底燒瓶中，加10 mL有機溶劑（氯仿）（甲醇）=9010）使其充分溶解。置于旋轉蒸發(fā)儀中，于65 在最大轉速時旋轉減壓蒸去溶劑，可見一層透明的膜附著于燒瓶上，真空干燥過夜。在所得產(chǎn)物中加入10 mL 10 mmol/L 緩沖溶液，將圓底燒瓶置于65

6、 熱水浴中旋渦水合2 h后超聲40 min，定容至10 mL。2.3  電泳條件    檢測波長：214 nm；壓力進樣：3.47 kPa×5 s；溫度：25 ；電壓：24 kV；運行緩沖液為10 mmol/L磷酸鹽或含脂質體的磷酸鹽或其它緩沖體系。實驗時毛細管用0.1 mol/L NaOH沖洗3 min，再用純水沖洗2 min，最后用背景緩沖液沖洗5 min。每次更換緩沖液時均用新緩沖液清洗5 min。樣品進樣前需超聲以脫氣，過0.45 m 濾膜, 以保證實驗的重復性。2.4  溶液的配制    精確稱

7、取阿魏酸10 mg，置于10 mL容量瓶中以甲醇定容，用微量移液器吸取0.5 mL移入5 mL容量瓶中，再以甲醇定容，制得濃度為100 mg/L的樣品溶液。    2.5  計算方法    脂質體與生物膜的結構相似性為LEKC描述藥物膜相互作用提供了物質基礎，藥物在含有脂質體溶液毛細管中的遷移時間與不含脂質體溶液中的遷移時間的變化能夠反映藥物與膜的相互作用。遷移時間取重復3次的平均值。LEKC的容量因子（k）涵蓋了藥物與脂質體的疏水、靜電及其它氫鍵、空間位阻等作用。Klw代表了溶質在脂質體相和水相的分配，可用來描述與脂質體結

8、合的程度，進而評價藥物與膜的相互作用。藥物在LEKC上的容量因子與脂水分配系數(shù)成線性比例，利用公式(1)(4)可計算LEKC中藥物的容量因子（k）、脂水分配系數(shù)(k)和吉布斯自由能變化值（）4,11。k（tt）/t（）k為容量因子，t為毛細管電泳緩沖溶液含脂質體時(即脂質體電動色譜，LEKC)藥物的遷移時間，t則為緩沖溶液無脂質體時（即毛細管區(qū)帶電泳，capillary zone electrophoresis， CZE）藥物的遷移時間。k=Klwlw(VlipVaq)=Klwv（)（v*（）（）v=（x×v）（）為相比，v 為總的偏摩爾特征體積（據(jù)式3計算），P為脂質體總濃度，CA

9、C 為臨界聚集濃度，接近于01，x 為脂質體中各種組分的摩爾百分比。v為脂質體中各種組分的偏摩爾特征體積，參照文獻1，1計算。 gTln（tt）（）Rg為標準氣體常數(shù)，T為熱力學溫度。3  結果與討論3.1  膽固醇含量對Klw的影響    在脂質體制備過程中加入不同比例的膽固醇，阿魏酸的Klw的對數(shù)值如圖1所示。膽固醇含量為0、10%、20%和30%時，lgKlw值分別為2.44、2.40、2.33和2.25?？梢钥闯?，Klw在脂質體無膽固醇時最大，且隨著脂質體中膽固醇含量的增加而減小。    

10、0; 圖1  膽固醇含量對lgKlw的影響（略）Fig.1  Effect of cholesterol contents on lgKlw緩沖液（buffer）：10 mmol/L磷酸鹽(phosphate)，pH 7.0。膽固醇含量由0變化到30%，由式（2）和式（3）計算得知，相比的變化可忽略，故影響Klw的主要因素為阿魏酸在CZE和LEKC中遷移時間。而遷移時間的變化反映了藥物與生物膜的相互作用。膽固醇像“緩沖劑”一樣起著調節(jié)生物膜結構流動性的作用。膽固醇本身不形成脂質雙層結構，但它能以高濃度方式摻入磷脂膜，引起膜性質的變化。膽固醇分子在雙層中的取向是其羥基緊靠磷脂

11、分子的極性頭部，其板狀的固醇環(huán)緊接極性頭部的碳氫鏈區(qū)域，并與之相互作用。隨著脂質體中膽固醇含量的增加，?；湹淖杂啥冉档?，從而使得脂質雙層排列更加緊密，脂質體的剛性和有序性增加，流動性降低，故藥物進入脂質體難度增加，分配進入脂質體的量減少，即Klw減小。3.2  緩沖溶液pH值對Klw的影響    毛細管壁硅醇基的解離常數(shù)1為1.0×10-3，故pH    不同pH緩沖液中阿魏酸的吉布斯自由能變化值如圖2b所示。G隨緩沖溶液的pH值的增大而增大。G越小，說明藥物與脂質體的相互作用越強，藥物更易進入生物膜內。

12、0; 圖2  緩沖液pH值對Klw(a)和(b)的影響（略）Fig.2  Effect of pH on Klw (a) and （b） of ferulic acid緩沖液（buffer): 10 mmol/L 磷酸鹽(phosphate)。3.3  緩沖體系對Klw的影響    阿魏酸在硼酸鹽、磷酸鹽和Tris(三羥甲基胺基甲烷)緩沖溶液中CZE和LEKC譜圖如圖3所示。圖中為阿魏酸在CZE中的峰位置， 2為阿魏酸在LEKC中的峰位置。緩沖液pH值為7.0，濃度均為10 mmol/L。從圖3中可以看出阿魏酸在相同濃度不同緩沖體系中

13、遷移時間差別較大。測試方式為CZE時，阿魏酸在硼酸鹽、磷酸鹽和Tris緩沖溶液中的遷移時間分別為13.13、3.82和5.94 min。測試方式為LEKC時，阿魏酸的遷移時間分別為19.41、5.29和7.49。硼酸鹽、磷酸鹽和Tris緩沖溶液中阿魏酸Klw的對數(shù)值分別為2.32、2.23和2.05。硼酸鹽緩沖液中Klw值最大，其次為磷酸鹽和Tris緩沖溶液，這可能與緩沖溶液離子強度有關。3種緩沖溶液在相同濃度下調節(jié)pH后，離子強度大小為：硼酸鹽>磷酸鹽>Tris。阿魏酸的Klw值隨緩沖溶液的離子強度的增大而增大。Carrozzino10發(fā)現(xiàn)在LEKC中，帶正電荷的溶質隨著離子強度

14、的增大，分配系數(shù)減小。這與本實驗結果是一致的。圖3  阿魏酸的（）和（）在不同緩沖液中的圖譜（略）ig.3  Capillary zone electrophoresis (CZE) (1) and liposome electrokinetic chromatogram (LEKC)(2) of ferulic acid in different buffera: 10 mmol/L硼酸鹽(borate), pH 7.0; b: 10 mmol/L磷酸鹽(phosphate), pH 7.0; c: 10 mmol/L tris, pH 7.0。這是因為緩沖溶液的離子不僅

15、對溶質分子的電荷起屏蔽作用，而且對脂質體表面的電荷也有屏蔽作用。溶質帶正電荷時，緩沖溶液的離子屏蔽了溶質的正電荷和脂質體的負電荷，削弱了溶質和脂質體的靜電作用，分配系數(shù)減小。而在本實驗條件下（pH7.0），溶質帶負電荷，緩沖溶液的離子屏蔽了溶質的負電荷和脂質體的負電荷，減弱了溶質和脂質體的排斥作用，兩者之間的結合程度增大，故分配系數(shù)增大。3.4  結論    實驗結果表明，膽固醇的加入降低了脂質體的流動性，使藥物在脂質體中的分配減小，Klw降低。緩沖溶液pH升高，阿魏酸的解離程度增大，與脂質體相互作用減弱，Klw降低。pH7.0時，在3種緩沖體系中（硼酸

16、鹽、磷酸鹽和Tris溶液），離子強度越大，離子對藥物和脂質體的負電荷的屏蔽作用越強，減弱了藥物與脂質體的排斥作用，Klw升高。    【參考文獻】  1 Raevsky O A, Schaper K J. Eur J Med Chem, 1998, 33(10): 7998072 Yang Q, Liu X Y, Umetani K. Bio. Acta, 1999, 1417(1): 1221303 Wang Zhiuan(王志宣), Deng Yingie（鄧英杰）, Zhang Xiaoeng（張曉鵬）. Chinese J. Acta

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