稻瘟病菌原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究

1、稻瘟病菌原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究尹良芬 1,2, 八重 樫 博志 3(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物科技學(xué)院 , 湖北 武漢 430070; 2. 湖北省作物病害監(jiān)測與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ,湖北 武漢 430070; 3. 日本佐賀大學(xué) 農(nóng)學(xué)部 , 日本佐賀縣 840-8502 摘 要 :原生質(zhì)體的制備一直是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的重要內(nèi)容 。 以稻瘟病菌作為供試菌株 , 優(yōu)化了其原生 質(zhì)體的制備條件 。 優(yōu)化的原生質(zhì)體制 備 條 件 包 括 :使 用 新 鮮 的 菌 絲 進(jìn) 行 接 種 ; 加 入 玻 璃 珠 一 起 培 養(yǎng) , 通 過 振 蕩使菌絲體破碎分離以獲得更多的生長點(diǎn) ; 菌懸液繼續(xù)加入

2、新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng) ; 原生質(zhì)體沉淀時(shí)選擇 3 000r /m i n 離心 10m i n, 保證最大限度地收集原生質(zhì)體 。 實(shí)驗(yàn)證明 , 通過這 4個(gè)條件優(yōu)化后 , 原生質(zhì)體的產(chǎn)量有了 極大的提高 , 每毫升酶液可制備 10 8109個(gè)原生質(zhì)體 。 關(guān)鍵詞 :原生質(zhì)體制備 ; 稻瘟病菌 ; 原生質(zhì)體產(chǎn)量中圖分類號(hào) :Q 813. 2; Q 949. 32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 :B 文章編號(hào) :1002-4956(2011 04-0033-03O p t i m i z i n g p r o c e s s o f p r o t o p l a s t p r e p a r a t i o n

3、 i n M a g n a p o r t h e o r y z a e Y i n L i a n g f e n 1,2, Y a e ga s h i H i r o s h i 3(1. C o l l e g e o f P l a n t S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y , H u a z h o n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y , W u h a n 430070, C h i n a ; 2. K e y L a b o r a t o r y o f C r o

4、 p D i s e a s e M o n i t o r i n g a n d S a f e t y C o n t r o l i n H u b e i , H u a z h o n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y , W u h a n 430070, C h i n a ; 3. F a c u l t y o f A g r i c u l t u r e , S a g a U n i v e r s i t y , S a g a 840-8502, J a pa n A b s t r a c t :P r

5、o t o p l a s t p r e p a r a t i o n i s a n i m p o r t a n t s t u d y i n m o d e r n m o l e c u l a r b i o l o g y . S e v e r a l c o n d i t i o n s i n p r e -p a r i n g t h e p r o t o p l a s t s o f M a g n a p o r t h e o r y z a e w e r e o p t i m i z e d . T h e o p t i m i z e d c

6、 o n d i t i o n s i n c l u d e d u s i n g f r e s h m y c e l i a o f M a g n a p o r t h e o r y z a e s t r a i n s t o i n o c u l a t e a d d i n g g l a s s b e a d s (10m m i n d i a m e t e r i n l i q u i d m e d i u m w h i l e i n c u b a t i n g , a n d s h a k i n g v i g o r o u s l

7、y e v e r y 4ht o e n c o u r a g e u n i f o r m g r o w t h o f m y c e l i u m. T h e c u l t u r e s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d t o p e t r i d i s h e s w i t h f r e s h l i q u i d m e d i u m a n d i n c u b a t e d a t 30 f o r o n e d a y . P r o t o p l a s t s w e r e d e p o

8、s t i o n b y c e n t r i f u g a t i n g a t 3 000r /m i n f o r 10m i n , t h i s s p e e d c o u l d d e c r e a s e t h e l o s s o f p r o t o p l a s t s m o s t l y . A f t e r t h e s e f o u r c o n d i t i o n s o p t i m i z e d , p r o t o p l a s t s w e r e e a s i l y o b t a i n e d

9、a t a b o u t 108109m L -1. K e y w o r d s :p r o t o p l a s t p r e p a r a t i o n ; m a g n a p o r t h e o r y z a e ; p r o t o p l a s t y i e l d 收稿日期 :2010-06-28基金項(xiàng)目 :日本教育 、 文化 、 體育 、 科學(xué)技術(shù)省 (文部省 基金項(xiàng)目 (11660050 作者簡介 :尹良芬 (1974 , 女 , 云南羅平 , 碩士 , 實(shí)驗(yàn)技術(shù)員 . E -m a i l :y i n f a n g l u o yi g m

10、 a i l . c o m 原生質(zhì)是有組織的生活物質(zhì) ,是 細(xì)胞 生命活動(dòng)的 物質(zhì)基礎(chǔ) 。 細(xì)胞內(nèi)由原生質(zhì)組成的各種結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱為原 生質(zhì)體 , 它們 彼 此 聯(lián) 系 、 相 互 影 響 而 構(gòu) 成 一 個(gè) 有 機(jī) 整體 , 擔(dān)負(fù)著細(xì)胞的所有生命活動(dòng) 1-3。 原生質(zhì)體具有全 能性 ,可以在人工控制條件下進(jìn)行各種各樣的操作 。 隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展 , 各 種分 子生物學(xué)技 術(shù) , 諸如轉(zhuǎn)基因工程技 術(shù) , 脈沖場電泳 技術(shù) , 原生 質(zhì) 體 融合技術(shù)等 , 被越來越多地運(yùn) 用到現(xiàn) 代的分子生物學(xué) 研究中 。 這些研究都離 不開原 生 質(zhì) 體 的提取跟制備 , 可以說沒有高濃度的原生質(zhì)體 ,

11、 這些 研究 也就無法進(jìn)行 。 因此原生質(zhì)體制備技術(shù)無論在理論上還是實(shí)踐上 都受到人們越來越多的重視 。 如何在短期內(nèi)高 效 、 簡 便地獲得大量的原生質(zhì)體就成為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究 的一個(gè)重點(diǎn)課題 。1 制備原生質(zhì)體的影響因素原生質(zhì)體制備過程中影響其產(chǎn)量的因素很多 , 歸 納起來有 :菌絲體的多少 ; 菌絲的菌齡 ; 酶的濃度 ; 酶解 時(shí)溫度 ; 酶解時(shí)間 ; 原生質(zhì)體收集時(shí)的離心速率等 。 (1原生質(zhì)體產(chǎn)量與菌絲體的多少的關(guān)系 。 原生 質(zhì)體的產(chǎn)量與菌絲體的多少成嚴(yán)格的正比關(guān)系 , 因此 要想增加原生質(zhì)體的產(chǎn)量就得提高菌絲體的量 。 菌絲 體的量可以通過延長培養(yǎng)時(shí)間以及增加接種種子的量 來

12、提高 ; 但延長培養(yǎng)時(shí)間會(huì)使菌齡增加 , 最終反而不利 于原生質(zhì)體的釋放 , 所以 通常的做法是通過增加接種I S S N 1002-4956C N 11-2034T 實(shí) 驗(yàn) 技 術(shù) 與 管 理 E x p e r i m e n t a l T e c h n o l o g y a n d M a n a g e m e n t 第 28卷 第 4期 2011年 4月 V o l . 28 N o . 4 A pr . 2011種子的量 , 也就是創(chuàng)造更多的 生長點(diǎn) 來實(shí)現(xiàn)菌絲體量 的增加 。(2 原生質(zhì)體產(chǎn)量與菌絲菌齡的關(guān)系 。 菌絲菌齡 越低 , 細(xì)胞壁對(duì)酶的作用就越敏感 , 所釋放的

13、原生質(zhì)體 的量也就越多 。 因?yàn)橛g的菌絲 的壁相對(duì)較薄 , 其 成 分也相對(duì)簡單 , 更易于 脫 除 , 且原生質(zhì) 體活性高 ; 但 隨 著菌齡的增加 , 壁生沉積色素 等次生 物質(zhì)阻礙酶的作 用 , 使壁難以解體而釋放原生質(zhì)體 , 因此原生質(zhì)體的量 反而呈明顯減少趨勢 4。(3 酶濃度 。 由 于 各 種 真 菌 的 成 分 不 盡 相 同 , 最 適宜的酶濃度也就不一樣 。 酶濃度未達(dá)到一定的值時(shí) 原生質(zhì)體不易釋放出來 , 但同時(shí) , 酶中往往含有對(duì)原生 質(zhì)體有害的物質(zhì) , 隨著酶量的增加 , 雜 質(zhì) (如過氧化物 酶 、 核糖核酸酶等 的濃度也會(huì)隨 之增加 , 當(dāng)達(dá)到一定 濃度時(shí) ,

14、必然會(huì)影響原生質(zhì)體的活性 。 此外 , 酶濃度過 大 , 細(xì)胞脫壁太徹底 、 易破裂 , 原生質(zhì)體量反而下降 , 因 此最佳酶濃度也是原生質(zhì)體制備的關(guān)鍵因素之一 5。 (4 酶解時(shí)的溫度 。 真菌的最適宜的酶解溫度為 30 35 , 對(duì)于大多數(shù)微生物來說 , 產(chǎn)生原生質(zhì)體的最適宜 酶解溫度都要高于微生物的最適生長溫度 。 在低于或者 高于該溫度時(shí) , 原生質(zhì)體的產(chǎn)率都有所下降 6-7。(5 酶解時(shí) 間 。 真 菌 的 原 生 質(zhì) 體 , 因 缺 少 細(xì) 胞 壁 而變得容易破裂 。 酶解過程中 , 隨著時(shí)間的增加 , 原生 質(zhì)體數(shù)量達(dá)到極限值便不再增加 , 反而呈下降趨勢 , 這 是由于酶解時(shí)間

15、過長 , 酶液對(duì) 于一些 早期釋放的原生 質(zhì)體細(xì)胞膜有破壞作用 , 影響原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定性 , 導(dǎo) 致原生質(zhì)體破碎 , 當(dāng)過量酶解 造成原 生質(zhì)體破裂速度 大于其形成速度時(shí) , 就會(huì)影響原生質(zhì)體形成的數(shù)量 5。 (6 離心速率 。 離心速率過低不利于原生質(zhì)體沉 淀 , 過高則菌絲等雜質(zhì)也一起 沉淀 。 為了 保證最大限 度地收集原生質(zhì)體 , 離心時(shí)選擇 3 000r /m i n 的速率運(yùn) 行 10m i n 來收集原生質(zhì)體 8-12。2 材料與試劑供試菌株 :稻瘟 病 菌 一 個(gè) 組 合 的 親 本 菌 株 S A 98-4、 Y 93-164-1及 后 代 菌 株 F 1-002、 F 1

16、-057; 另 一 個(gè) 組 合的親本 菌 株 84R -62B 、 Y 93-245c -2及 后 代 菌 株 F 1-312、 F 1-326、 F 1-376、 F 1-378。試劑 :C M 液體培養(yǎng)基 (6g 酵母 , 6g T r y p t i c S o y -b r o t h , 10g 蔗糖 , 定容到 1 000m L ; OM 緩沖液 (1. 2 m o l M g S O 4和 10m m o l N a 2H P O 4, p H 值為 5. 8 ; 山 梨醇緩沖液 (91g 山 梨 醇 溶 于 1L 超 純 水 中 , 濾 過 滅 菌 ; S T C 緩 沖 液

17、(1m o l 山 梨 醇 , 50m o l T r i s -H C l , p H 值為 8. 0, 50m m o l C a C l 2·2H 2O 。主要酶類 :裂解酶 (l y s i n g e n z y m e s 3 實(shí)驗(yàn)(1 取一片 帶 有 稻 瘟 病 菌 菌 絲 保 存 于 -25 冰 箱中的干燥濾子片接種到 P D A 斜 面 培 養(yǎng) 基 上 , 25 黑暗培養(yǎng) 5d 。(2 用接種針從斜面培養(yǎng)基表面刮取新鮮稻瘟病 菌絲 , 并接種到帶有 10粒玻璃珠的 C M 液體培養(yǎng)基中 , 25 黑暗培養(yǎng) 3d , 每 4h 振動(dòng) 1次 , 使連在一起的菌絲 體分開

18、 ; 培養(yǎng)完畢后繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 30m i n , 使菌絲體充 分破碎以制備均一的菌懸液 。 刮取菌絲時(shí)注意從表面 輕輕刮擦 , 避免挑到菌絲體以外的瓊脂塊等雜質(zhì) 。 (3 在超凈工作臺(tái)中將菌懸液分別加到 10皿裝有 新鮮 C M 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中 , 然后 30 黑暗培養(yǎng) 1d 。 (4 用滅過菌的紗 布 過 濾 收 集 菌 絲 , 先 用 滅 菌 水 沖洗菌絲 2次 , 然后用 OM 緩沖液 沖 洗 一 次 , 沖 洗 后 的菌絲體加入到含有 10m g /m L 裂解酶的 20m L OM 緩沖液中 , 200r /m i n 、 32 下振動(dòng)培養(yǎng) 4h 。(5 加入 20m L 山梨醇緩

19、沖液 , 3 000r /m i n 離心 10m i n 。(6 沉淀物用 10m L S T C 緩沖液洗滌 2次后 , 再 次懸浮于 1m L S T C 緩沖液中 。4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果4. 1 稻瘟病菌原生質(zhì)體的形態(tài)觀察從酶解 4h 的酶解液中取原生質(zhì)體于顯微鏡下觀 察其形態(tài) :稻瘟病菌原生質(zhì)體為透明球狀實(shí)體 , 可觀察 到內(nèi)含物 , 原生質(zhì)體大小不均一 。4. 2 稻瘟病菌原生質(zhì)體產(chǎn)量測定本實(shí)驗(yàn)使用 25×16型的血球計(jì)數(shù)板來測定稻瘟 病菌原生質(zhì)體的數(shù)量 。 從 4h 酶解液中取 1L 原生 質(zhì)體懸濁液并用水稀釋到 100L , 之后用血球計(jì)數(shù)板 計(jì)數(shù) 。 每個(gè)供試菌株都讀取 5

20、個(gè) 25方格 (中間跟四周 各選 1個(gè) 25方 格 的 原 生 質(zhì) 體 數(shù) , 然 后 計(jì) 算 平 均 值 。 每 m L 酶解液所含原生質(zhì)體數(shù)的計(jì)算方法 :原生質(zhì) 體 數(shù) /m L=5個(gè) 25方 格 原 生 質(zhì) 體 平 均 數(shù) ×16×10 000×稀釋倍數(shù) 100。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 1, 表中 25方格原生質(zhì)體數(shù)為 5次平均值 。表 1 稻瘟病菌各供試菌株的原生質(zhì)體產(chǎn)量菌株名25方格原生質(zhì)體數(shù) /個(gè)每毫升原生質(zhì)體數(shù) /108 m L -1S A 98-4 65. 4 10. 50Y 93-164a -1 88. 4 14. 10F 1-002 36. 8 58.

21、 90F 1-057 31 4. 9643實(shí) 驗(yàn) 技 術(shù) 與 管 理表 1(續(xù) 菌株名 25方格原生質(zhì)體數(shù) /個(gè) 每毫升原生質(zhì)體數(shù) /108 m L -184R -62B 36. 2 5. 79Y 93-245c -2 16. 8 2. 69F 1-312 40. 8 6. 53F 1-326 54. 2 8. 67F 1-376 115. 2 1. 84F 1-37862. 49. 98 從表 1可 以 看 出 ,本 實(shí) 驗(yàn) 中 供 試 稻 瘟 病 菌 株 原 生 質(zhì)體的產(chǎn)量通常為 108109個(gè) /m L 。 為了了解本實(shí)驗(yàn)中稻瘟病菌原生質(zhì)體產(chǎn)量跟其他 真菌原生質(zhì)體 產(chǎn) 量 的 差 別 ,

22、 特 做 了 比 較 , 比 較 結(jié) 果 見 表 2。 從表 2可以 看 出 :本 實(shí) 驗(yàn) 的 稻 瘟 病 菌 的 原 生 質(zhì) 體 產(chǎn)量是其 他 真 菌 原 生 質(zhì) 體 產(chǎn) 量 的 10到 10 000倍 ; 而 且 , 同樣是稻瘟病菌的原生質(zhì)體制備 , 本實(shí)驗(yàn)原生質(zhì)體 產(chǎn)量是其他報(bào)道的原生質(zhì)體產(chǎn)量的 10 000倍 。 這說明 本實(shí)驗(yàn)的這幾個(gè)優(yōu)化條件對(duì)提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量是非 常有效的 。 同時(shí) , 本 研 究 的 原 生 質(zhì) 體 產(chǎn) 量 是 目 前 已 經(jīng) 報(bào)道的真菌的最高產(chǎn)量 。表 2 本實(shí)驗(yàn)中稻瘟病菌原生質(zhì)體量跟其他真菌的比較 5 討論(1通過這 4個(gè)關(guān)鍵步驟的條件優(yōu)化后 , 最大限度

23、地簡化了實(shí)驗(yàn)過程 , 不需要使用攪拌機(jī)破碎 , 僅使用幾 個(gè)玻璃珠就能 獲 得 菌 懸 液 ,因 此 省 了 攪 拌 過 程 跟 清 洗 攪拌機(jī)的過程 , 既省錢又省事 。 同時(shí) , 因?yàn)榫z體破碎 過程就在三角 瓶 里 進(jìn) 行 , 避 免 了 把 培 養(yǎng) 液 倒 出 來 破 碎 的步驟 , 從而大大降低了菌液被污染的機(jī)會(huì) 。(2本實(shí)驗(yàn)使用 新 鮮 菌 絲 進(jìn) 行 培 養(yǎng) , 因 為 新 鮮 的 菌 絲 生 長 力 旺 盛 , 能 保 證 短 期 內(nèi) 獲 得 大 量 菌 絲 體 的要求 。 老的菌絲 , 尤其是長期放置已經(jīng) 發(fā) 黑 的 菌 絲 有 很多是死亡的 菌 絲 體 , 不 僅 生 長

24、力 有 限 , 而 且 會(huì) 給 后 期的原生質(zhì) 體 提 取 帶 來 大 量 不 容 易 去 除 的 雜 質(zhì) 。 菌 絲體經(jīng)過攪拌破碎后繼續(xù)培養(yǎng) ,保證盡 可 能 地 得 到 足 夠多的 菌 絲 體 , 增 大 菌 絲 體 跟 C M 培 養(yǎng) 液 的 接 觸 面積 , 從而創(chuàng)造更多的生長點(diǎn)為后期獲得 大 量 的 菌 絲 體 做準(zhǔn)備 。(3破碎后的菌懸液加入新鮮 C M 培養(yǎng)液培養(yǎng)一 天后就收集菌 絲 體 , 這 樣 就 保 證 了 所 收 獲 的 都 是 低 齡 菌絲 ,從而有 利 于 酶 解 脫 壁 而 釋 放 原 生 質(zhì) 體 。 本 實(shí) 驗(yàn) 原生質(zhì)體制備過程中所使用的其他條件 :酶的濃度 (

25、10m g/m L 、 酶解溫度 (32 和酶解時(shí)間 (4h 都是經(jīng)過 前人大量研究 總 結(jié) ,并 通 過 本 實(shí) 驗(yàn) 所 證 實(shí) 的 最 有 利 于 提高原生質(zhì)體產(chǎn)量的條件 。 正因?yàn)橛辛诉@些條件的優(yōu) 化組合 , 本實(shí)驗(yàn) 所 獲 得 的 原 生 質(zhì) 體 產(chǎn) 量 才 會(huì) 達(dá) 到 前 所 未有的最高水平 。 參考文獻(xiàn) (R e f e r e n c e s1M u r a l i d h a r R V , P a n d a T. F u n g a l p r o t o p l a s t f u s i o n J . B i o pr o c e s s E n g i n e e

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