稻瘟病菌原生質體制備條件優(yōu)化實驗研究

1、稻瘟病菌原生質體制備條件優(yōu)化實驗研究尹良芬 1,2, 八重 樫 博志 3(1. 華中農業(yè)大學 植物科技學院 , 湖北 武漢 430070; 2. 湖北省作物病害監(jiān)測與安全控制重點實驗室 ,湖北 武漢 430070; 3. 日本佐賀大學 農學部 , 日本佐賀縣 840-8502 摘 要 :原生質體的制備一直是現代分子生物學研究的重要內容 。 以稻瘟病菌作為供試菌株 , 優(yōu)化了其原生 質體的制備條件 。 優(yōu)化的原生質體制 備 條 件 包 括 :使 用 新 鮮 的 菌 絲 進 行 接 種 ; 加 入 玻 璃 珠 一 起 培 養(yǎng) , 通 過 振 蕩使菌絲體破碎分離以獲得更多的生長點 ; 菌懸液繼續(xù)加入

2、新鮮培養(yǎng)液進行培養(yǎng) ; 原生質體沉淀時選擇 3 000r /m i n 離心 10m i n, 保證最大限度地收集原生質體 。 實驗證明 , 通過這 4個條件優(yōu)化后 , 原生質體的產量有了 極大的提高 , 每毫升酶液可制備 10 8109個原生質體 。 關鍵詞 :原生質體制備 ; 稻瘟病菌 ; 原生質體產量中圖分類號 :Q 813. 2; Q 949. 32 文獻標志碼 :B 文章編號 :1002-4956(2011 04-0033-03O p t i m i z i n g p r o c e s s o f p r o t o p l a s t p r e p a r a t i o n

3、 i n M a g n a p o r t h e o r y z a e Y i n L i a n g f e n 1,2, Y a e ga s h i H i r o s h i 3(1. C o l l e g e o f P l a n t S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y , H u a z h o n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y , W u h a n 430070, C h i n a ; 2. K e y L a b o r a t o r y o f C r o

4、 p D i s e a s e M o n i t o r i n g a n d S a f e t y C o n t r o l i n H u b e i , H u a z h o n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y , W u h a n 430070, C h i n a ; 3. F a c u l t y o f A g r i c u l t u r e , S a g a U n i v e r s i t y , S a g a 840-8502, J a pa n A b s t r a c t :P r

5、o t o p l a s t p r e p a r a t i o n i s a n i m p o r t a n t s t u d y i n m o d e r n m o l e c u l a r b i o l o g y . S e v e r a l c o n d i t i o n s i n p r e -p a r i n g t h e p r o t o p l a s t s o f M a g n a p o r t h e o r y z a e w e r e o p t i m i z e d . T h e o p t i m i z e d c

6、 o n d i t i o n s i n c l u d e d u s i n g f r e s h m y c e l i a o f M a g n a p o r t h e o r y z a e s t r a i n s t o i n o c u l a t e a d d i n g g l a s s b e a d s (10m m i n d i a m e t e r i n l i q u i d m e d i u m w h i l e i n c u b a t i n g , a n d s h a k i n g v i g o r o u s l

7、y e v e r y 4ht o e n c o u r a g e u n i f o r m g r o w t h o f m y c e l i u m. T h e c u l t u r e s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d t o p e t r i d i s h e s w i t h f r e s h l i q u i d m e d i u m a n d i n c u b a t e d a t 30 f o r o n e d a y . P r o t o p l a s t s w e r e d e p o

8、s t i o n b y c e n t r i f u g a t i n g a t 3 000r /m i n f o r 10m i n , t h i s s p e e d c o u l d d e c r e a s e t h e l o s s o f p r o t o p l a s t s m o s t l y . A f t e r t h e s e f o u r c o n d i t i o n s o p t i m i z e d , p r o t o p l a s t s w e r e e a s i l y o b t a i n e d

9、a t a b o u t 108109m L -1. K e y w o r d s :p r o t o p l a s t p r e p a r a t i o n ; m a g n a p o r t h e o r y z a e ; p r o t o p l a s t y i e l d 收稿日期 :2010-06-28基金項目 :日本教育 、 文化 、 體育 、 科學技術省 (文部省 基金項目 (11660050 作者簡介 :尹良芬 (1974 , 女 , 云南羅平 , 碩士 , 實驗技術員 . E -m a i l :y i n f a n g l u o yi g m

10、 a i l . c o m 原生質是有組織的生活物質 ,是 細胞 生命活動的 物質基礎 。 細胞內由原生質組成的各種結構統(tǒng)稱為原 生質體 , 它們 彼 此 聯(lián) 系 、 相 互 影 響 而 構 成 一 個 有 機 整體 , 擔負著細胞的所有生命活動 1-3。 原生質體具有全 能性 ,可以在人工控制條件下進行各種各樣的操作 。 隨著現代分子生物學的發(fā)展 , 各 種分 子生物學技 術 , 諸如轉基因工程技 術 , 脈沖場電泳 技術 , 原生 質 體 融合技術等 , 被越來越多地運 用到現 代的分子生物學 研究中 。 這些研究都離 不開原 生 質 體 的提取跟制備 , 可以說沒有高濃度的原生質體 ,

11、 這些 研究 也就無法進行 。 因此原生質體制備技術無論在理論上還是實踐上 都受到人們越來越多的重視 。 如何在短期內高 效 、 簡 便地獲得大量的原生質體就成為現代分子生物學研究 的一個重點課題 。1 制備原生質體的影響因素原生質體制備過程中影響其產量的因素很多 , 歸 納起來有 :菌絲體的多少 ; 菌絲的菌齡 ; 酶的濃度 ; 酶解 時溫度 ; 酶解時間 ; 原生質體收集時的離心速率等 。 (1原生質體產量與菌絲體的多少的關系 。 原生 質體的產量與菌絲體的多少成嚴格的正比關系 , 因此 要想增加原生質體的產量就得提高菌絲體的量 。 菌絲 體的量可以通過延長培養(yǎng)時間以及增加接種種子的量 來

12、提高 ; 但延長培養(yǎng)時間會使菌齡增加 , 最終反而不利 于原生質體的釋放 , 所以 通常的做法是通過增加接種I S S N 1002-4956C N 11-2034T 實 驗 技 術 與 管 理 E x p e r i m e n t a l T e c h n o l o g y a n d M a n a g e m e n t 第 28卷 第 4期 2011年 4月 V o l . 28 N o . 4 A pr . 2011種子的量 , 也就是創(chuàng)造更多的 生長點 來實現菌絲體量 的增加 。(2 原生質體產量與菌絲菌齡的關系 。 菌絲菌齡 越低 , 細胞壁對酶的作用就越敏感 , 所釋放的

13、原生質體 的量也就越多 。 因為幼齡的菌絲 的壁相對較薄 , 其 成 分也相對簡單 , 更易于 脫 除 , 且原生質 體活性高 ; 但 隨 著菌齡的增加 , 壁生沉積色素 等次生 物質阻礙酶的作 用 , 使壁難以解體而釋放原生質體 , 因此原生質體的量 反而呈明顯減少趨勢 4。(3 酶濃度 。 由 于 各 種 真 菌 的 成 分 不 盡 相 同 , 最 適宜的酶濃度也就不一樣 。 酶濃度未達到一定的值時 原生質體不易釋放出來 , 但同時 , 酶中往往含有對原生 質體有害的物質 , 隨著酶量的增加 , 雜 質 (如過氧化物 酶 、 核糖核酸酶等 的濃度也會隨 之增加 , 當達到一定 濃度時 ,

14、必然會影響原生質體的活性 。 此外 , 酶濃度過 大 , 細胞脫壁太徹底 、 易破裂 , 原生質體量反而下降 , 因 此最佳酶濃度也是原生質體制備的關鍵因素之一 5。 (4 酶解時的溫度 。 真菌的最適宜的酶解溫度為 30 35 , 對于大多數微生物來說 , 產生原生質體的最適宜 酶解溫度都要高于微生物的最適生長溫度 。 在低于或者 高于該溫度時 , 原生質體的產率都有所下降 6-7。(5 酶解時 間 。 真 菌 的 原 生 質 體 , 因 缺 少 細 胞 壁 而變得容易破裂 。 酶解過程中 , 隨著時間的增加 , 原生 質體數量達到極限值便不再增加 , 反而呈下降趨勢 , 這 是由于酶解時間

15、過長 , 酶液對 于一些 早期釋放的原生 質體細胞膜有破壞作用 , 影響原生質體膜的穩(wěn)定性 , 導 致原生質體破碎 , 當過量酶解 造成原 生質體破裂速度 大于其形成速度時 , 就會影響原生質體形成的數量 5。 (6 離心速率 。 離心速率過低不利于原生質體沉 淀 , 過高則菌絲等雜質也一起 沉淀 。 為了 保證最大限 度地收集原生質體 , 離心時選擇 3 000r /m i n 的速率運 行 10m i n 來收集原生質體 8-12。2 材料與試劑供試菌株 :稻瘟 病 菌 一 個 組 合 的 親 本 菌 株 S A 98-4、 Y 93-164-1及 后 代 菌 株 F 1-002、 F 1

16、-057; 另 一 個 組 合的親本 菌 株 84R -62B 、 Y 93-245c -2及 后 代 菌 株 F 1-312、 F 1-326、 F 1-376、 F 1-378。試劑 :C M 液體培養(yǎng)基 (6g 酵母 , 6g T r y p t i c S o y -b r o t h , 10g 蔗糖 , 定容到 1 000m L ; OM 緩沖液 (1. 2 m o l M g S O 4和 10m m o l N a 2H P O 4, p H 值為 5. 8 ; 山 梨醇緩沖液 (91g 山 梨 醇 溶 于 1L 超 純 水 中 , 濾 過 滅 菌 ; S T C 緩 沖 液

17、(1m o l 山 梨 醇 , 50m o l T r i s -H C l , p H 值為 8. 0, 50m m o l C a C l 2·2H 2O 。主要酶類 :裂解酶 (l y s i n g e n z y m e s 3 實驗(1 取一片 帶 有 稻 瘟 病 菌 菌 絲 保 存 于 -25 冰 箱中的干燥濾子片接種到 P D A 斜 面 培 養(yǎng) 基 上 , 25 黑暗培養(yǎng) 5d 。(2 用接種針從斜面培養(yǎng)基表面刮取新鮮稻瘟病 菌絲 , 并接種到帶有 10粒玻璃珠的 C M 液體培養(yǎng)基中 , 25 黑暗培養(yǎng) 3d , 每 4h 振動 1次 , 使連在一起的菌絲 體分開

18、 ; 培養(yǎng)完畢后繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 30m i n , 使菌絲體充 分破碎以制備均一的菌懸液 。 刮取菌絲時注意從表面 輕輕刮擦 , 避免挑到菌絲體以外的瓊脂塊等雜質 。 (3 在超凈工作臺中將菌懸液分別加到 10皿裝有 新鮮 C M 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中 , 然后 30 黑暗培養(yǎng) 1d 。 (4 用滅過菌的紗 布 過 濾 收 集 菌 絲 , 先 用 滅 菌 水 沖洗菌絲 2次 , 然后用 OM 緩沖液 沖 洗 一 次 , 沖 洗 后 的菌絲體加入到含有 10m g /m L 裂解酶的 20m L OM 緩沖液中 , 200r /m i n 、 32 下振動培養(yǎng) 4h 。(5 加入 20m L 山梨醇緩

19、沖液 , 3 000r /m i n 離心 10m i n 。(6 沉淀物用 10m L S T C 緩沖液洗滌 2次后 , 再 次懸浮于 1m L S T C 緩沖液中 。4 實驗結果4. 1 稻瘟病菌原生質體的形態(tài)觀察從酶解 4h 的酶解液中取原生質體于顯微鏡下觀 察其形態(tài) :稻瘟病菌原生質體為透明球狀實體 , 可觀察 到內含物 , 原生質體大小不均一 。4. 2 稻瘟病菌原生質體產量測定本實驗使用 25×16型的血球計數板來測定稻瘟 病菌原生質體的數量 。 從 4h 酶解液中取 1L 原生 質體懸濁液并用水稀釋到 100L , 之后用血球計數板 計數 。 每個供試菌株都讀取 5

20、個 25方格 (中間跟四周 各選 1個 25方 格 的 原 生 質 體 數 , 然 后 計 算 平 均 值 。 每 m L 酶解液所含原生質體數的計算方法 :原生質 體 數 /m L=5個 25方 格 原 生 質 體 平 均 數 ×16×10 000×稀釋倍數 100。 實驗結果見表 1, 表中 25方格原生質體數為 5次平均值 。表 1 稻瘟病菌各供試菌株的原生質體產量菌株名25方格原生質體數 /個每毫升原生質體數 /108 m L -1S A 98-4 65. 4 10. 50Y 93-164a -1 88. 4 14. 10F 1-002 36. 8 58.

21、 90F 1-057 31 4. 9643實 驗 技 術 與 管 理表 1(續(xù) 菌株名 25方格原生質體數 /個 每毫升原生質體數 /108 m L -184R -62B 36. 2 5. 79Y 93-245c -2 16. 8 2. 69F 1-312 40. 8 6. 53F 1-326 54. 2 8. 67F 1-376 115. 2 1. 84F 1-37862. 49. 98 從表 1可 以 看 出 ,本 實 驗 中 供 試 稻 瘟 病 菌 株 原 生 質體的產量通常為 108109個 /m L 。 為了了解本實驗中稻瘟病菌原生質體產量跟其他 真菌原生質體 產 量 的 差 別 ,

22、 特 做 了 比 較 , 比 較 結 果 見 表 2。 從表 2可以 看 出 :本 實 驗 的 稻 瘟 病 菌 的 原 生 質 體 產量是其 他 真 菌 原 生 質 體 產 量 的 10到 10 000倍 ; 而 且 , 同樣是稻瘟病菌的原生質體制備 , 本實驗原生質體 產量是其他報道的原生質體產量的 10 000倍 。 這說明 本實驗的這幾個優(yōu)化條件對提高原生質體的產量是非 常有效的 。 同時 , 本 研 究 的 原 生 質 體 產 量 是 目 前 已 經 報道的真菌的最高產量 。表 2 本實驗中稻瘟病菌原生質體量跟其他真菌的比較 5 討論(1通過這 4個關鍵步驟的條件優(yōu)化后 , 最大限度

23、地簡化了實驗過程 , 不需要使用攪拌機破碎 , 僅使用幾 個玻璃珠就能 獲 得 菌 懸 液 ,因 此 省 了 攪 拌 過 程 跟 清 洗 攪拌機的過程 , 既省錢又省事 。 同時 , 因為菌絲體破碎 過程就在三角 瓶 里 進 行 , 避 免 了 把 培 養(yǎng) 液 倒 出 來 破 碎 的步驟 , 從而大大降低了菌液被污染的機會 。(2本實驗使用 新 鮮 菌 絲 進 行 培 養(yǎng) , 因 為 新 鮮 的 菌 絲 生 長 力 旺 盛 , 能 保 證 短 期 內 獲 得 大 量 菌 絲 體 的要求 。 老的菌絲 , 尤其是長期放置已經 發(fā) 黑 的 菌 絲 有 很多是死亡的 菌 絲 體 , 不 僅 生 長

24、力 有 限 , 而 且 會 給 后 期的原生質 體 提 取 帶 來 大 量 不 容 易 去 除 的 雜 質 。 菌 絲體經過攪拌破碎后繼續(xù)培養(yǎng) ,保證盡 可 能 地 得 到 足 夠多的 菌 絲 體 , 增 大 菌 絲 體 跟 C M 培 養(yǎng) 液 的 接 觸 面積 , 從而創(chuàng)造更多的生長點為后期獲得 大 量 的 菌 絲 體 做準備 。(3破碎后的菌懸液加入新鮮 C M 培養(yǎng)液培養(yǎng)一 天后就收集菌 絲 體 , 這 樣 就 保 證 了 所 收 獲 的 都 是 低 齡 菌絲 ,從而有 利 于 酶 解 脫 壁 而 釋 放 原 生 質 體 。 本 實 驗 原生質體制備過程中所使用的其他條件 :酶的濃度 (

25、10m g/m L 、 酶解溫度 (32 和酶解時間 (4h 都是經過 前人大量研究 總 結 ,并 通 過 本 實 驗 所 證 實 的 最 有 利 于 提高原生質體產量的條件 。 正因為有了這些條件的優(yōu) 化組合 , 本實驗 所 獲 得 的 原 生 質 體 產 量 才 會 達 到 前 所 未有的最高水平 。 參考文獻 (R e f e r e n c e s1M u r a l i d h a r R V , P a n d a T. F u n g a l p r o t o p l a s t f u s i o n J . B i o pr o c e s s E n g i n e e

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