泌尿系結(jié)石的基因診斷和治療

1、泌尿系結(jié)石的基因診斷和治療【關鍵詞】 泌尿系結(jié)石 泌尿系結(jié)石是泌尿系統(tǒng)最常見的疾病之一，在我國一般人群中發(fā)病率高達1%-10%1。其中約25%的患者需住院治療，在泌尿外科住院患者中占居首位。近年來，我國泌尿系結(jié)石的發(fā)病率有增加趨勢，是世界上三大結(jié)石高發(fā)區(qū)之一。 隨著體外沖擊波碎石術(extracorporeal shock wave lithotripsy, ESWL)、經(jīng)皮腎鏡取石術(percutaneous nephrolithotripsy, PNL)、輸尿管腎鏡取石術(ureterorenoscope lithotripsy, URL)、腹腔鏡取石術(laparoscope litho

2、tomy)等一系列新技術的陸續(xù)出現(xiàn)，泌尿系結(jié)石的治療逐漸走向微創(chuàng)化并日臻成熟。而枸櫞酸鹽、受體阻滯劑等多種溶石、排石藥物的出現(xiàn)也使排石治療有了長足進步。然而，泌尿系結(jié)石的復發(fā)率仍然居高不下，結(jié)石的反復復發(fā)?？梢鹉I功能損害，同時，泌尿系結(jié)石的發(fā)病率仍有繼續(xù)升高的趨勢。因此，針對其病因的診斷和防治逐漸成為泌尿外科工作者關注的重點。 飲食、環(huán)境和遺傳為影響泌尿系結(jié)石發(fā)病的三大因素。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物技術的迅速發(fā)展，泌尿系結(jié)石的遺傳因素越來越引起人們關注。而人類基因組計劃的順利完成和后基因組時代的飛速發(fā)展使得基因診斷和治療成為可能。目前已發(fā)現(xiàn)大約有30多種泌尿系結(jié)石致病基因，它們可直接或間接引

3、起泌尿系結(jié)石的發(fā)生，而一些新的基因在不斷地被發(fā)現(xiàn)。特別是一些單基因疾病如原發(fā)性高草酸尿癥、黃嘌呤尿癥等在基因診斷治療上有著切實的可操作性。本文就泌尿系結(jié)石的基因診斷和治療做一初步的探討。 1 泌尿系結(jié)石的基因診斷 1.1 基因診斷的發(fā)展現(xiàn)狀 基因診斷即DNA診斷或分子遺傳學診斷，是指以DNA或RNA作為檢測對象的疾病診斷方法。自1983年Mullis等2首次將聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)技術運用于鐮狀細胞性貧血的基因分析后，基因診斷技術得到了飛速的發(fā)展，衍生出為數(shù)眾多的新技術和新方法。人類基因組計劃的完成使得大多數(shù)致病基因的定位成為可能，推動基

4、因診斷技術成為遺傳性疾病或遺傳相關疾病的最直接、最準確的診斷手段?；蛟\斷經(jīng)過十多年的發(fā)展，現(xiàn)已廣泛應用于感染性疾病、腫瘤、遺傳性疾病等的診斷和預后判斷。 1.2 基因診斷的策略 對于已經(jīng)定位了基因的遺傳性疾病，可以通過直接檢測該基因來進行診斷。但對于基因未知的遺傳性疾病或遺傳相關性疾病，基因的定位診斷的策略尤為重要。致病基因的定位策略主要有以下幾條：利用蛋白組學技術搜索差異蛋白，通過對差異蛋白的質(zhì)譜分析來獲得致病基因或致病基因相關基因的信息，最終可將致病基因定位于基因組的某一區(qū)段；對第一代DNA遺傳標記限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymo

5、rphism, RFLP)、第二代DNA遺傳標記微衛(wèi)星多態(tài)性(microsatellite polymorphisms, SiFR)、第三代DNA遺傳標記單核苷酸多態(tài)性(single nucletide polymorphisms, SNPs)進行遺傳連鎖分析，將致病基因定位于基因組的某一區(qū)段，最終分離出致病基因；利用比較基因組雜交(comparative genomic hybridization, CGH)系統(tǒng)地檢測整個染色體基因組的獲得和丟失，最終獲得致病位點。在人類基因組中有超過300萬個以上的SNPs，其密度可以達到1/1000bp，通過SNPs進行遺傳連鎖分析來定位致病基因是一種非

6、常有前景的技術，現(xiàn)已廣泛應用于遺傳性疾病或遺傳相關性疾病的基因的篩查和診斷。 1.3 基因診斷的技術方法 從PCR到基因芯片，基因診斷的技術方法為數(shù)眾多。基因芯片(gene chip)技術是近年來在生命科學領域中迅速發(fā)展起來的一項高新技術，是由微電子學、物理學、化學、計算機科學與生命科學交叉綜合的高科技技術?？筛咄俊⒏哽`敏度、高特異性地分析DNA(cDNA)，有助于對疾病的發(fā)病機理的研究，尋找疾病診斷和治療的靶分子。遺傳多態(tài)性連鎖分析是基于DNA遺傳標記如RFLP、STR、SNPs的遺傳連鎖分析(linkage analysis)及關聯(lián)分析(association analysis)，可用于

7、疾病易感基因定位，尤其是以SNPs為遺傳標記的第三代DNA多態(tài)性遺傳連鎖分析，可對致病基因或易感基因進行精細定位?；诟咄康幕蛐酒蚐NPs的遺傳連鎖分析是目前的研究熱點。 1.4 基因診斷在泌尿系結(jié)石中的應用 1.4.1 原發(fā)性高草酸尿癥型 原發(fā)性高草酸尿癥I型(primary hyperoxaluria type 1, PH1)是一種比較罕見的常染色體隱性遺傳病，每60000-120000兒童中有1例患者，其特點是肝臟丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine glyoxylate aminotransferase, AGT)缺陷，導致內(nèi)源性草酸合成增加，血草酸、尿草酸含量明顯升高，最終出現(xiàn)全

8、身草酸鹽沉著癥、泌尿系草酸鈣結(jié)石、終末期腎病。確診常依賴于肝活檢和AGT酶活性測定。此類患者目前有效的治療方法只有肝移植或肝腎聯(lián)合移植，而患者的早期診斷尤為重要。AGT定位于過氧化物酶體中，由單拷貝基因AGXT編碼，AGXT定位于人2q37.3，AGXT的突變導致AGT錯誤定位于線粒體或無法形成二聚體等異常可能是PH1的分子基礎。Milosevic等3利用末端標記循環(huán)測序法成功確診了三個疑似PH1的家系，認為該方法較肝活檢無創(chuàng)、簡單，可以早期甚至產(chǎn)前診斷PH1，并可適用于先證者的無癥狀親屬的篩查。Pirulli等4通過變性高效液相色譜法篩查了20個PH1患者的AGXT基因，發(fā)現(xiàn)了AGXT基因中

9、的13個突變位點和1個多態(tài)性位點，認為這種方便快捷的新技術可以適用于尿石癥患者AGXT突變位點的篩選和健康攜帶者AGXT多態(tài)性位點的篩查。其他方法諸如單鏈構象多態(tài)性(SSCP)也有報道。AGXT上已發(fā)現(xiàn)超過50個突變，這些突變?？蓪е翽H1。Rumsby5認為對AGXT基因上突變位點的檢測可作為PH1診斷的一線檢查。 1.4.2 原發(fā)性高草酸尿癥型 原發(fā)性高草酸尿癥型(primary hyperoxaluria type 2, PH2)也是一種常染色體隱性遺傳病，較PH1更為罕見，臨床癥狀較PH1為輕，起病稍晚。其特點是肝臟羥基丙酮酸/乙醛酸還原酶(GRHPR)缺陷，該酶由GRHPR基因編碼，

10、定位于9cen。GRHPR的缺陷導致肝臟生成的內(nèi)源性草酸合成增加。確診常依賴于肝活檢和GRHPR酶活性測定。Cramer6和Cregeen7分別聯(lián)合應用PCRSSCP和測序技術對4例和19例患者的GRHPR基因進行了分析，發(fā)現(xiàn)了11個突變位點和2個多態(tài)性位點，認為GRHPR基因的突變是導致PH2的分子機制。Webster等8利用STR等技術對11名患者的基因進行了連鎖分析，發(fā)現(xiàn)GRHPR上的兩個突變位點。PH2的基因診斷在目前還不能代替肝活檢，但隨著PH2的分子機制的闡明和突變位點的不斷發(fā)現(xiàn)，DNA診斷有可能成為診斷PH2理想的手段。 1.4.3 特發(fā)性草酸鈣結(jié)石 PH引起的遺傳性草酸鈣結(jié)石比

11、較少見，臨床上常見的是特發(fā)性草酸鈣結(jié)石(idiopathic calcium oxalate stone)，其特點是缺乏明確的遺傳背景，有一定的家族聚集現(xiàn)象，找不到明顯的致病原因，可占草酸鈣結(jié)石全部病例數(shù)的80%以上。特發(fā)性草酸鈣結(jié)石病是一個復雜的、多病因的疾病，是環(huán)境和遺傳因素共同作用的結(jié)果，其特征是尿高鈣、高草酸、低枸櫞酸和高尿酸，也有人提出尿中的葡萄糖胺、鎂離子和某些蛋白質(zhì)對促進或抑制結(jié)石形成有作用。Goodman等9利用計算機模型，通過方差分析、HardyWeinberg分析、分離分析研究了101例結(jié)石患者和101例對照的遺傳模式，認為可能有3或4個主要基因參與了特發(fā)性草酸鈣結(jié)石的形成

12、。目前，對于特發(fā)性草酸鈣結(jié)石的致病基因或易感基因尚不了解，有待于進一步研究。 1.4.4 胱氨酸尿癥 胱氨酸尿癥是一種常染色體隱性遺傳病，每2000-15000新生兒中可發(fā)現(xiàn)1例，其特點是腎臟和腸道氨基二羧酸(如胱氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸等)轉(zhuǎn)運缺陷，其中胱氨酸溶解度較低而易析出形成結(jié)石。胱氨酸尿癥型(cystinuria, type 1)的致病基因為SLC 3A1，定位在2p21。胱氨酸尿癥型(cystinuria, type 2)和胱氨酸尿癥型(cystinuria, type 3)的致病基因為SLC 7A9，定位在19q13.1。Skopkova等10通過對24個胱氨酸尿癥家系的SL

13、C 3A1和SLC 7A9直接測序，在SLC 3A1上發(fā)現(xiàn)了10個突變位點，在SLC 7A9上發(fā)現(xiàn)了6個突變位點，認為這些突變位點的分布和頻率是導致胱氨酸尿癥的重要因素。Brauers等11對2個非型胱氨酸尿癥家系進行基因連鎖分析，發(fā)現(xiàn)SLC 7A5基因與非型胱氨酸尿癥密切相關，可能是非型胱氨酸尿癥的新的致病基因。隨著胱氨酸尿癥的分子機制的解析，對胱氨酸尿癥相關基因的突變位點的檢測將成為胱氨酸尿癥基因治療的重要基礎。 近年來，其他疾病諸如特發(fā)性高鈣尿癥、低枸櫞酸尿癥等的分子機制研究也得到了長足的發(fā)展。分子遺傳學的發(fā)展必將推動基因診斷在泌尿系結(jié)石中的應用。 2 泌尿系結(jié)石的基因治療 2.1 基因

14、治療的研究現(xiàn)狀 基因治療是指將外源基因片段(DNA或RNA)導入靶細胞或組織，以糾正或補償基因的缺陷，封閉或抑制異?；虻谋磉_，從而達到治療的目的。Anderson12于1984年首先全面闡述了基因治療的一般原理。1995年，Blaese等13報道了世界上首例成功的基因治療，他們運用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將正常的腺苷脫氨酶(adenosine deaminase, ADA)基因?qū)階DASCID患兒的體內(nèi)，治療后患兒細胞及體液免疫功能及臨床癥狀明顯改善。在最近20年里，基因治療得到了飛速的發(fā)展，成為惡性腫瘤、遺傳性疾病、免疫性疾病、感染性疾病等最有前景的治療手段。 2.2 基因治療的策略 2.2.1

15、糾正或補償基因的缺陷 理論上糾正或補償基因的缺陷在臨床中易于實踐，缺陷基因如惡性腫瘤中的抑癌基因、遺傳性疾病中的大多數(shù)致病基因，只要用適當?shù)妮d體將其導入就可以達到治療的目的。 2.2.2 封閉或抑制異?；虻谋磉_ 異?；蛉鐞盒阅[瘤中的癌基因、免疫性疾病中的炎性基因等，其表達產(chǎn)物常在疾病的進展中起到關鍵的作用，封閉或抑制其表達可以達到治療的目的。實現(xiàn)的手段有基因敲除(knock out)、反義寡核苷酸(ODNs)、反義RNA(antisense RNA)、核酶(ribozyme)、RNA干擾(RNA interference, RNAi)等。其中RNAi技術是近年來研究的熱點。 2.2.3 R

16、NA激活基因 一般認為小片段的非編碼RNA在基因的調(diào)節(jié)中只有沉默基因的作用，即RNAi現(xiàn)象。但最近有學者發(fā)現(xiàn)小RNA在某些基因調(diào)節(jié)中也可以起到激活作用，并命名為“基因激活(dsRNAinduced gene activation, RNAa)”。Science雜志評價這一發(fā)現(xiàn)“將是一強有力的生物學工具并可以發(fā)展為癌癥等疾病的新的治療手段”。 2.3 基因治療的載體 基因治療的關鍵問題之一是如何將目的基因?qū)氚屑毎?，并可以按我們預期的方式適當?shù)乇磉_。理想的載體必須是高效、穩(wěn)定、可控的，并且具有良好的靶向性。目前基因治療的載體尚有待進一步改造。一般載體可分為病毒載體和非病毒載體。 2.3.1 病毒

17、載體 常見的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(retrovirus, RV)、慢病毒載體(lentivirus, LV)、腺病毒載體(adenovirus, AV)、腺相關病毒載體(adenoassociated virus, AAV)等。這些病毒往往是細胞的自然感染者，在基因的導入上占據(jù)了天然的優(yōu)勢。病毒載體都需要進行一定程度的改造，將部分對人體毒害較大或基因轉(zhuǎn)移中不需要的基因刪除，留下空間插入目的基因。RV和LV可穩(wěn)定整合于宿主DNA，長期表達目的基因，但整合宿主DNA有可能引起插入突變，導致宿主基因組相關基因表達異常。AV載體容量大，最高可達36kb，不整合宿主DNA，表達效率高，但AV載體免

18、疫原性強，表達時間相對較短。AAV載體可定向整合于人19號染色體的長臂，不引起插入突變，可長期穩(wěn)定表達，但容量小，最大僅4.4kb，且需要輔助病毒。各種病毒載體在基因的承載上各有優(yōu)缺點，目前尚無比較完美的病毒載體。 2.3.2 非病毒載體 非病毒載體相對于病毒載體來說低毒、低免疫原性、外源基因整合概率低、無基因插入片段大小限制、使用簡單、制備方便、易于生產(chǎn)、便于保存和檢驗，但目前非病毒載體表達時間短，轉(zhuǎn)染效率低，仍需進一步改造。常用的非病毒載體有真核表達質(zhì)粒、脂質(zhì)體、陽離子聚合物、納米顆粒等等。 2.4 基因治療在泌尿系結(jié)石中的應用 2.4.1 原發(fā)性高草酸尿癥型 AGXT基因的定位及分子機制

19、的闡明使PH1的治療初現(xiàn)曙光，早在1995年Danpure15就對PH1的基因治療進行了探討，并認為PH1是基因治療理想的候選疾病。Cochat16認為PH1適合基因治療的原因有三：PH1是一種慢性進行性疾病，合并癥可逆，且無中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累；PH1是單基因疾病，其分子機制比較清楚；PH1是肝臟疾病而治療基因易于靶向肝臟。Koul17將正常的AGXT基因插入真核表達載體pEGFPC1并在真核細胞HepG2表達，證實外源性的AGT在真核細胞可以高效表達并正常定位。理論上用表達載體將正常的AGT導入肝臟就可達到基因治療的目的。然而，迄今尚無切實可行的基因治療方法。主要問題在于PH1患者所有的肝細胞

20、都在過量生成草酸，只有大多數(shù)肝細胞都被導入正常AGXT基因才能達到效果18，但目前的基因治療的載體效率較低，遠不能達到這個目的19。尋找更有效的載體或者在胚胎期進行基因治療是可能的解決手段。近年來腸道產(chǎn)甲酸草酸桿菌(oxalobacter formigenes, Ox.F)的深入研究給PH的治療帶來了新的希望，Hoppe20通過給與PH患者口服Ox.F的治療取得了一定的效果，但長期療效仍不明確。Ox.F分解草酸的酶均已被克隆，Ye等21發(fā)現(xiàn)將Ox.F的草酸分解酶導入真核細胞可使后者獲得分解草酸的能力，Hoppe20認為利用Ox.F的草酸分解酶也許可以成為治療PH1的新策略。 2.4.2 原發(fā)性

21、高草酸尿癥型 PH2在治療上主要是限制草酸攝入、處理合并癥，但最終不可避免需要進行腎移植或肝腎聯(lián)合移植。與PH1類似，如何解決基因轉(zhuǎn)移的效率問題是PH2基因治療的關鍵。 2.4.3 胱氨酸尿癥 胱氨酸尿癥的基因治療目前為止研究不多。Knoll等22通過Ho：YAG激光將裸質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)染到腎臟近曲小管細胞中，并獲得了穩(wěn)定的表達，他認為這可能是胱氨酸尿癥的一種非常有希望的基因治療新途徑。近來，Knoll領導的研究小組通過反義技術封閉SLC3A1基因獲得了穩(wěn)定的胱氨酸尿癥型的細胞模型，并在此基礎上正在進行基于慢病毒載體的基因治療的研究。 其他疾病中基因治療的發(fā)展不多，但隨著泌尿系結(jié)石病因在分子遺

22、傳學水平上的突破，泌尿系結(jié)石的基因治療必將顯示出其強大的生命力。 3 泌尿系結(jié)石的基因診斷和治療的展望 近年來，在基因水平上的數(shù)個重大突破如人類基因組計劃的完成、RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)等使得生物醫(yī)學的面貌大為改觀，在分子遺傳學水平上實現(xiàn)疾病的診斷和治療有了賴以建立的平臺。泌尿系結(jié)石是一種多因素的疾病，而其遺傳因素越來越得到人們的重視。加強對泌尿系結(jié)石的病因研究，完全破解泌尿系結(jié)石的分子機制，最終實現(xiàn)從基因水平防治泌尿系結(jié)石，是泌尿系結(jié)石研究的方向。【參考文獻】 1葉章群. 泌尿系結(jié)石研究現(xiàn)況與展望 J. 中華實驗外科雜志, 2005, 22(3):261262.2Saiki RK, Scharf

23、S, Faloona F, et al. Enzymatic amplification of beta.globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia J. Science, 1985, 230(4732):13501354.3Milosevic D, Rinat C, Batinic D, et al. Genetic analysisa diagnostic tool for primary hyperoxaluria type J. Pediatr Ne

24、phrol, 2002, 17(11):896898.4Pirulli D, Giordano M, Lessi M, et al. Detection of AGXT gene mutations by denaturing highperformance liquid chromatography for diagnosis of hyperoxaluria type J. Clin Exp Med, 2001, 1(2):99104.5Rumsby G, Williams E, CoulterMaekie M. Evaluation of mutation screening as a

25、first line test for the diagnosis of the primary hyperoxalurias J. Kidney Int, 2004, 66(3):959963.6Cramer SD, Ferree PM, Lin K, et al. The gene encoding hydroxypyruvate reductase (GRHPR) is mutated in patients with primary hyperoxaluria type J. Hum Mol Genet, 1999, 8(11):20632069.7Cregeen DP, Willia

26、ms EL, Hulton S, et al. Molecular analysis of the glyoxylate reductase (GRHPR) gene and description of mutations underlying primary hyperoxaluria type 2 J. Hum Mutat, 2003, 22(6):497.8Webster KE, Ferree PM, Holmes RP, et al. Identification of missense, nonsense, and deletion mutations in the GRHPR g

27、ene in patients with primary hyperoxaluria type (PH2) J. Hum Genet, 2000, 107(2):176185.9Goodman HO, Holmes RP, Assimos DG. Genetic factors in calcium oxalate stone disease J. J Urol, 1995, 153(2):301307.10Skopkova z, Hrabincova E, Stastna S, et al. Molecular genetic analysis of SLC3A1 and SLC7A9 ge

28、nes in Czech and Slovak cystinuric patients J. Ann Hum Genet, 2005, 69(Pt 5):501507.11Brauers E, Vester U, Zerres K, et al. Search for mutations in SLClA5(19q13) in cystinuria patients J. J Inherit Metab Dis, 2005, 28(6):1169117112Anderson WF. Prospects for human gene therapy J. Science, 1984, 226(4

29、673):401409.13Blaese RM, Culver KW, Miller AD, et al. T lymphocytedirected gene therapy for ADASCID: initial trial results after 4 years J. Science, 1995, 270(5235):475480.14Li LC, Okino ST, Zhao H, et al. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells J. Proc Natl Acad Sci USA, 2006,

30、 103(46):1733717342.15Danpure CA. Advances in the enzymology and molecular genetics of primary hyperoxaluria type 1. Prospects for gene therapy J. Nephrol Dial Transplant, 1995, 10(Suppl 8):2429.16Cochat P. Primary hyperoxaluria type 1 J. Kidney Int, 1999, 55(6):25332547.17KouI S, Johnson T, Pramanik S, et al. Cellular tran