實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定ppt課件

1、1實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定n1臺可見光分光光度計(jì)配套臺可見光分光光度計(jì)配套4個(gè)玻璃比色杯，用完個(gè)玻璃比色杯，用完務(wù)必立刻洗凈、晾干。切忌用試管刷或粗糙布務(wù)必立刻洗凈、晾干。切忌用試管刷或粗糙布(紙紙)擦拭。擦拭。n實(shí)驗(yàn)終了后，務(wù)必將運(yùn)用過的玻璃器皿洗凈、晾實(shí)驗(yàn)終了后，務(wù)必將運(yùn)用過的玻璃器皿洗凈、晾干、放回原處。干、放回原處。P40/P512n學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)，掌握學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)，掌握pH值法測定蛋值法測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的普通原理和操作方法。白質(zhì)等電點(diǎn)的普通原理和操作方法。n學(xué)習(xí)和掌握雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度的原理和操學(xué)習(xí)和掌握雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃

2、度的原理和操作方法。作方法。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定4n蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在溶液中存在如下平衡：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在溶液中存在如下平衡：5n蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為零時(shí)的蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為零時(shí)的pH值稱為蛋白質(zhì)的等值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)電點(diǎn)pI。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子在電場中不向。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子在電場中不向任何一極挪動，而且分子與分子間因碰撞而引起聚沉任何一極挪動，而且分子與分子間因碰撞而引起聚沉的傾向添加，所以這時(shí)可以使蛋白質(zhì)溶液的粘度、浸的傾向添加，所以這時(shí)可以使蛋白質(zhì)溶液的粘度、浸透壓均減到最低，且溶液變混濁。透壓均減到最低，且溶液變混濁。n牛乳中的酪蛋白的等電點(diǎn)

3、是牛乳中的酪蛋白的等電點(diǎn)是4.7-4.8。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)在不同在不同pH溶液中構(gòu)成的混濁度來確定，即混濁度最大溶液中構(gòu)成的混濁度來確定，即混濁度最大時(shí)的時(shí)的pH值即為該種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)值。值即為該種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)值。6n 實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器n 4支支15mL玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍200uL、槍頭、槍頭200uL等。等。n 實(shí)驗(yàn)資料和試劑實(shí)驗(yàn)資料和試劑n 蒸餾水、蒸餾水、1M醋酸、醋酸、0.1M醋酸、醋酸、0.01M醋酸、酪蛋醋酸、酪蛋白溶液。白溶液。7n每小組取每小組取4支支15mL玻璃試管，按下表順序分別準(zhǔn)確地玻璃試管，按下表順序分

4、別準(zhǔn)確地參與各試劑，參與后立刻混勻，加一管，搖勻一管。參與各試劑，參與后立刻混勻，加一管，搖勻一管。管號管號H2O/mL0.01M HAC/mL0.1MHAC/mL1M HAC/mLpH酪蛋白溶酪蛋白溶液液/mL察看景象察看景象min0 10 20 18.400.6-5.91 28.7-0.3-5.31 38.00-1.00-4.71 47.40-1.603.51 n靜置，察看各管在不同時(shí)間的混濁度。最混濁的一管靜置，察看各管在不同時(shí)間的混濁度。最混濁的一管pH即為即為酪蛋白的等電點(diǎn)。察看時(shí)可用酪蛋白的等電點(diǎn)。察看時(shí)可用+，+，+，表示渾濁度。，表示渾濁度。8n察看各管中清澈度變化，記錄結(jié)果察

5、看各管中清澈度變化，記錄結(jié)果 用用+，+，+，表示渾濁度并解釋景象。表示渾濁度并解釋景象。n確定酪蛋白的等電點(diǎn)。確定酪蛋白的等電點(diǎn)。n蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)沉淀的緣由是什么？影響該實(shí)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)沉淀的緣由是什么？影響該實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的要素有哪些？驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的要素有哪些？蛋白質(zhì)含量的測定蛋白質(zhì)含量的測定雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量11n雙縮脲雙縮脲NH3CONHCONH3是兩分子尿素經(jīng)是兩分子尿素經(jīng)180左右加熱，放出左右加熱，放出1個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。n在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲能與在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲能與Cu 構(gòu)成紫紅色絡(luò)構(gòu)成紫紅色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反響。合物，稱為雙縮脲反響。n

6、凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接銜接的肽鍵，或能凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接銜接的肽鍵，或能過過1個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反響。蛋白質(zhì)含有多個(gè)肽鍵，可發(fā)生雙縮雙縮脲反響。蛋白質(zhì)含有多個(gè)肽鍵，可發(fā)生雙縮脲反響。脲反響。2+12n紫紅色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，紫紅色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，顏色深淺而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，顏色深淺可在可在540 nm比色測定，故可用此法來測定蛋白質(zhì)比色測定，故可用此法來測定蛋白質(zhì)含量。測定的蛋白質(zhì)濃度范圍為含量。測定的蛋白質(zhì)濃度范圍為1-10 mg/

7、mL。n此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要缺陷是靈敏度深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要缺陷是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需求快速，但并不需求差。因此雙縮脲法常用于需求快速，但并不需求非常準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)測定。非常準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)測定。13n 實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器n 6支支15mL玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍200uL、槍頭槍頭200uL、可見光分光光度計(jì)等。繪制規(guī)范曲線、可見光分光光度計(jì)等。繪制規(guī)范曲線n 2支支15mL玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍200uL

8、、槍頭槍頭200uL、可見光分光光度計(jì)等。樣品測定、可見光分光光度計(jì)等。樣品測定n 實(shí)驗(yàn)資料和試劑實(shí)驗(yàn)資料和試劑n 雙縮脲試劑、規(guī)范牛血清蛋白、蒸餾水、待測樣品可以雙縮脲試劑、規(guī)范牛血清蛋白、蒸餾水、待測樣品可以用酪蛋白溶液，也可用牛乳中提取的酪蛋白。用酪蛋白溶液，也可用牛乳中提取的酪蛋白。14n1.規(guī)范曲線的繪制。全班繪制規(guī)范曲線的繪制。全班繪制1份即可份即可n取取6支支15mL試管，編號試管，編號0-5，按下表順序參與各試劑。，按下表順序參與各試劑。試劑試劑/mL/mL試管試管0 01 12 23 34 45 5規(guī)范牛血潔白規(guī)范牛血潔白蛋白蛋白0.00.00.40.40.80.81.21.

9、21.61.62.02.0蒸餾水蒸餾水2.02.01.61.61.21.20.80.80.40.40.00.0雙縮脲試劑雙縮脲試劑4.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.0蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量 mg/mLmg/mL0.00.02.02.04.04.06.06.08.08.010.010.015 上述試劑加完后，充分混勻，室溫放置上述試劑加完后，充分混勻，室溫放置30 min。 以以0號管為對看管，于號管為對看管，于540 nm處比色測定吸光值，記處比色測定吸光值，記下各管吸光度。下各管吸光度。 以每管蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，對應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)，以每管蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)

10、，對應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)，作吸光度作吸光度-蛋白質(zhì)含量規(guī)范曲線。見電腦桌面蛋白質(zhì)含量規(guī)范曲線。見電腦桌面Excel表格表格“規(guī)范曲線繪制規(guī)范曲線繪制16n2.蛋白質(zhì)樣品測定蛋白質(zhì)樣品測定 每小組做每小組做1份份n 1.另取另取2支試管，分別加支試管，分別加1 mL未知濃度的酪蛋白蛋白未知濃度的酪蛋白蛋白質(zhì)樣品液留意樣品濃度不要超越質(zhì)樣品液留意樣品濃度不要超越10 mg/mL，加，加1 mL蒸餾水，加蒸餾水，加4 mL雙縮脲試劑，混勻，室溫放置雙縮脲試劑，混勻，室溫放置30 min。n 2.2支樣品溶液于支樣品溶液于540nm處比色測定吸光值。處比色測定吸光值。n 3. 取兩組樣品測定的吸光值平均值

11、，根據(jù)回歸方程計(jì)取兩組樣品測定的吸光值平均值，根據(jù)回歸方程計(jì)算出相應(yīng)蛋白質(zhì)的算出相應(yīng)蛋白質(zhì)的 濃度。濃度。n 4.按以下公式計(jì)算出樣品蛋白質(zhì)的含量：按以下公式計(jì)算出樣品蛋白質(zhì)的含量：樣品蛋白質(zhì)含量樣品蛋白質(zhì)含量mg/100 mL=YN100/V 式中，式中，Y為規(guī)范曲線查得的蛋白質(zhì)的量為規(guī)范曲線查得的蛋白質(zhì)的量mg，N為稀釋倍數(shù)，為稀釋倍數(shù)，V為樣品所取的體積為樣品所取的體積mL。y = 0.042x - 0.000417樣品蛋白質(zhì)含量樣品蛋白質(zhì)含量mg/100 mL=YN100/V2.計(jì)算樣品蛋白質(zhì)的含量計(jì)算樣品蛋白質(zhì)的含量 式中，式中，Y為規(guī)范曲線查得的蛋白質(zhì)的量為規(guī)范曲線查得的蛋白質(zhì)的量mg，N為稀釋為稀釋倍數(shù)，倍數(shù)，V為樣品所取的體積為樣品所取的體積mL。1.繪制蛋白質(zhì)規(guī)范曲線繪制蛋白質(zhì)規(guī)范曲線18n影響規(guī)范曲線的要素有哪些？影響規(guī)范曲線的要素有哪些？n蛋白質(zhì)含量測定中需求留意什么問題？蛋白質(zhì)含量測定中需求留意什么問題？19n等電點(diǎn)測定的實(shí)驗(yàn)要求各種試劑的濃度和參與量必等電點(diǎn)測定的實(shí)驗(yàn)要求各種試劑的濃度和參與量必需非常準(zhǔn)確。需非常準(zhǔn)確。n規(guī)范曲線選擇不能只看規(guī)范曲線選擇不能只看R ，還應(yīng)該看曲線斜率和截，還應(yīng)該看曲線斜率和截距。距。R 大小與實(shí)驗(yàn)操作和儀器都有關(guān)系。大小與實(shí)驗(yàn)操作和儀器都有關(guān)系。 n顯色時(shí)間過長，能夠會出現(xiàn)霧狀沉淀，影響比色。顯色時(shí)間過長