抗氧化劑和NFκB對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS表達(dá)的影響

1、    抗氧化劑和NFB對(duì)大鼠肺微血管 內(nèi)皮細(xì)胞iNOS表達(dá)的影響        摘要目的：探討NFB在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS基因誘導(dǎo)表達(dá)中的作用及抗氧化劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞iNOS誘導(dǎo)表達(dá)的影響及其機(jī)制。方法：Griess法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO-水平以反映NO的生成，Northern印跡分析iNOS mRNA水平，EMSA法測(cè)定細(xì)胞核內(nèi)NFB的結(jié)合活性。結(jié)果：抗氧化劑可阻斷內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系LPS和TNF誘導(dǎo)的NO生成及iNOS mRNA的表達(dá)；LPS和TNF可誘導(dǎo)

2、大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞NFB的激活并可被抗氧化劑阻斷。結(jié)論：LPS和TNF 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞iNOS基因表達(dá)依賴于NFB的激活；抗氧化劑可通過(guò)抑制NFB的活化而阻斷iNOS基因的誘導(dǎo)表達(dá)。主題詞一氧化氮；抗氧化藥；內(nèi)皮中分類號(hào)R318.04文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1000-4718(2000)01-0020-04 Effect of antioxidant and NFB on the induction of iNOS gene in rat pulmonary microvascular endothelial cells in vitroLIU Qing-hang, JIN Hui-ming,

3、WU Zhao-hui, CHEN Yu, LIU Kai(Department of Pathophysiology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)Abstract AIM:To investigate the role of nuclear factor B (NFB) in the induction of iNOS gene by TNF and LPS in endothelial cells and the effect of antioxidant on the induction of iNOS. ME

4、THODS:Nitrite was determined based on Griess reaction. iNOS mRNA was analyzed using Northern blot. NFB in the cell nucleole was detected with electrophoretic mobility shift assay.RESULTS:(1)NO production and iNOS mRNA expression induced by LPS and TNF was blocked by pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)

5、 or N-acetylcysteine(NAC). (2)LPS and TNF triggered the activation and translocation of NFB, and PDTC or NAC inhibited the activation of NFB induced by LPS and TNF.CONCLUSIONS:(1)The induction of iNOS gene by TNF and LPS is dependent on the activation of NFB.(2)Antioxidants may inhibit the induction

6、 of iNOS gene through the inhibition of NFB activation.MeSHNitric Oxide; Antioxidants; Endothelium內(nèi)皮細(xì)胞在多種細(xì)胞因子或內(nèi)毒素作用下表現(xiàn)出一些新的特性，如細(xì)胞表面粘附分子及主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)抗原的表達(dá)，產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表達(dá)，使內(nèi)皮參與活躍的免疫反應(yīng)，此過(guò)程稱為內(nèi)皮細(xì)胞的激活1。內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)度激活將導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)一系

7、列表型變化并產(chǎn)生如動(dòng)脈粥樣硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。其中內(nèi)皮細(xì)胞iNOS的過(guò)度表達(dá)所致的內(nèi)皮細(xì)胞低反應(yīng)性及內(nèi)皮細(xì)胞的損傷在炎癥、免疫性疾病及內(nèi)毒素休克的發(fā)病過(guò)程中具有重要意義。研究表明內(nèi)皮細(xì)胞激活時(shí)iNOS表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。iNOS基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)包括NFB、AP-1、NF-IL6，Oct-1等2，而核因子B(nuclear factor B, NFB)被認(rèn)為在多種參與炎癥反應(yīng)的蛋白質(zhì)因子的基因調(diào)控中擔(dān)任重要角色，因而可能是內(nèi)皮細(xì)胞激活的調(diào)控中一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄激活因子2，3。據(jù)報(bào)道巨噬細(xì)胞，腎系膜細(xì)胞中iNOS的表達(dá)依賴于NFB的活化，但NFB與內(nèi)皮細(xì)胞iNOS

8、基因誘導(dǎo)表達(dá)的關(guān)系報(bào)道較少。本文探討NFB在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS基因誘導(dǎo)表達(dá)中的使用。另外，抗氧化劑被認(rèn)為是NF活化的有效抑制劑，因而，本文亦研究抗氧化劑對(duì)于LPS和TNF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞iNOS表達(dá)的影響及其機(jī)制。材料和方法一、材料：重組人腫瘤壞死因子-(recombined human tumor necrosis factor-， TNF-)，大腸桿菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)，N-acetylcysteine(NAC)購(gòu)自Sigma公司，無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基，小牛血清購(gòu)自Gibco

9、公司，Dig High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit , Dig Gel Shift Kit購(gòu)自Boehringer Manhaim公司。二、方法：(一)細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照我們以往報(bào)道的方法4。選用體重100 g左右的雄性SD大鼠，烏拉坦腹腔注射麻醉，腹腔內(nèi)注射肝素(1000 U/100 g BW)，左心室切口，從右心室緩慢灌注10 mL D-Hanks液至肺葉顏色變白。小心剪取邊緣肺組織，進(jìn)而剪切成1 mm×1 mm×1mm小塊，按12塊/cm密度接種于培養(yǎng)瓶，用含20%小牛血清的DME

10、M培養(yǎng)液培養(yǎng)6070 h后去除組織塊，換液，直至長(zhǎng)成致密單層。此細(xì)胞已應(yīng)用抗vWF抗體及內(nèi)皮細(xì)胞抗體CD31進(jìn)行免疫組化鑒定并應(yīng)用相差顯微鏡和電鏡進(jìn)行形態(tài)鑒定，非內(nèi)皮細(xì)胞少于5%4。使用傳代至23代的細(xì)胞，細(xì)胞在加入藥物處理前12 h所用培養(yǎng)液血清濃度降為0.5%。進(jìn)行NO?水平測(cè)定用的細(xì)胞培養(yǎng)體系使用無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基。(二)NO水平的測(cè)定：根據(jù)Griess反應(yīng)原理，用我室改良的方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO?水平以反映NO的生成4。培養(yǎng)上清液經(jīng)離心后取100 L加入等量的Griess反應(yīng)液1%磺胺；0.1% N-1-萘乙二胺(溶劑為5%磷酸)混勻，室溫放置10 min，應(yīng)用酶標(biāo)比色儀Bio

11、rad 450于540 nm處進(jìn)行光密度測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為NO-濃度。(三)探針的制備與標(biāo)記：應(yīng)用RT-PCR方法制備用于Northern雜交的探針5。所用的引物序列為：(1)GAPDH：5-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3；5-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3；(2)iNOS:5-GTG TTC CAC CAG GAG ATG TTG-3；5-CTC CTG CCC ACT GAG TTC GTC-3。所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠分離并純化用以制備探針。探針的標(biāo)記應(yīng)用“Dig High Prime DNA Labeling and

12、Detection Starter Kit ”試劑盒，按說(shuō)明書進(jìn)行地高辛隨機(jī)引物法標(biāo)記并檢測(cè)標(biāo)記效率。(四)Northern印跡分析：細(xì)胞總RNA抽提采用文獻(xiàn)報(bào)道的一步法，1%瓊脂糖-甲醛變性膠電泳，毛細(xì)管法轉(zhuǎn)移至尼龍膜，預(yù)雜交3 h，雜交過(guò)夜，洗膜。應(yīng)用“Dig High Prime DNA Labeling and Detection Start Kit ”試劑盒檢測(cè)，至觀察到藍(lán)紫色條帶后即終止反應(yīng)。條帶經(jīng)光密度掃描，將比值(iNOS mRNA/GAPDH mRNA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。(五)EMSA(electrophoretic mobility shift assay)：核蛋白的提取參照S

13、ingh等的方法6。核蛋白質(zhì)定量采用考馬斯亮蘭G-250染色法。NFB識(shí)別的特異性雙鏈DNA序列5-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3采用地高辛標(biāo)記，步驟參見(jiàn)“Gel Shift Kit”說(shuō)明。取4 g核蛋白質(zhì)與標(biāo)記的雙鏈探針混合，室溫下孵育30 min，然后進(jìn)行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，緩沖液為0.25×TBE， 4電泳23 h，電泳后的凝膠轉(zhuǎn)移至尼龍膜，固定，應(yīng)用“Dig Gel Shift Kit”試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。(六)統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)以<"01.jpg (732 字節(jié))" src="/med/cano/2010

14、03/20100310161311392.jpg" 15 17>±s表示，應(yīng)用t檢驗(yàn)測(cè)試均數(shù)差異顯著性。結(jié)果一、抗氧化劑可阻斷內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系NO的誘導(dǎo)生成：大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)LPS(1 g/mL)和TNF(100 U/mL)作用24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO?水平顯著高于對(duì)照組(P0.01， n=5)。提示LPS及TNF可誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成。而在培養(yǎng)體系預(yù)先加入抗氧化劑PDTC(0.1 mmol/L)或NAC(20 mmol/L)1.5 h則可顯著抑制LPS及TNF誘導(dǎo)的NO的生成(P0.01，n=5)(1A)。另外，抗氧化劑PDTC及NAC對(duì)內(nèi)

15、皮細(xì)胞NO誘生的抑制作用呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(1B，C)。     Fig 1Accumulation of nitrite in rat pulmonary microvascular endothelial cells(RPMECs) culture medium(A)RPMECs were treated with LPS(1 g/mL)+TNF (100 U/mL) for 24 h, or preincubated for 1.5 h with PDTC (0.1 mmol/L) or NAC (20 mmol/L) then for the n

16、ext 24 h with LPS(1 g/mL)+TNF(100 U/mL).(B)RPMECs were preincubated with various concentrations of PDTC for 1.5 h and for the next 24 h with LPS (1 g/mL)+TNF(100 U/mL).(C)RPMECs were preincubated with various concentrations of PDTC for 1.5 h and for the next 24 h with LPS(1 g/mL)+TNF(100 U/mL)1大鼠肺微血

17、管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO?水平的變化二、LPS和TNF可誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞NFB的激活：應(yīng)用LPS(1 g/mL)和TNF(100 U/mL)處理大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞2 h，即可觀察到較明顯的NFB結(jié)合活性；而應(yīng)用PDTC(0.1 mmol/L)或NAC(20 mmol/L)預(yù)處理1.5 h后則NFB的結(jié)合活性被顯著抑制(P0.05，n=3)(2)。提示抗氧化劑可以抑制LPS及TNF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NFB的激活及核內(nèi)轉(zhuǎn)位。    Fig 2EMSA of NFB in RPMECs(1)Control (2) LPS(1 g/mL)+TNF(100 U/

18、mL)(3)LPS (1 g/mL)+TNF(100 U/mL)+PDTC(0.1 mmol/L)(4)LPS (1 g/mL)+TNF(100 U/mL)+NAC(20 mmol/L)2大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞NFB結(jié)合活性的EMSA分析(在相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)3次，得到類似結(jié)果)三、抗氧化劑可阻斷大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS mRNA的誘導(dǎo)表達(dá)：Northern Blot分析表明未經(jīng)刺激的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS mRNA水平不能檢出，而加入LPS(1 g/mL)和TNF(100 U/mL)處理2 h，則觀察到iNOS mRNA明顯的誘導(dǎo)表達(dá)(光密度值升至0.375±0.086，與

19、對(duì)照組比P0.05，n=3)。預(yù)先應(yīng)用抗氧化劑PDTC或NAC處理1.5 h則可顯著抑制TNF及LPS誘導(dǎo)的iNOS mRNA表達(dá)水平(光密度值分別降至0.018±0.011及0.026±0.019，與TNF+LPS組比P0.05，n=3)，而GAPDH mRNA的表達(dá)水平則不受PDTC及NAC的影響(P0.05，n=3)(3)。    Fig 3(A)RT-PCR amplification of iNOS and GAPDH mRNA in RPMECs1.LPS (1 g/mL)+TNF (100 U/mL)2.RPMECs(C

20、ontrol)3.4.GAPDH(B)Northern Blot analysis of iNOS mRNA using cDNA probes(1)Control (2) LPS(1 g/mL)+TNF (100 U/mL) (3)LPS(1 g/mL)+TNF (100 U/mL)+PDTC(0.1 mmol/L) (4)LPS (1 g/mL)+TNF(100 U/mL)+NAC(20 mmol/L)3(A)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS及GAPDH mRNA的RT-PCR擴(kuò)增(B)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS表達(dá)的Northern Blot分析(在相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)3次，得到類似結(jié)果)討

21、論內(nèi)皮細(xì)胞的激活往往表現(xiàn)為一系列特定基因的表達(dá)。目前的研究表明，這些基因結(jié)構(gòu)存在一個(gè)共同點(diǎn)，即其5端啟動(dòng)子區(qū)域的NFB的結(jié)合位點(diǎn)，其中iNOS基因亦具有NFB的調(diào)控作用位點(diǎn)。本文發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素及TNF可激活微血管內(nèi)皮細(xì)胞NFB并使之向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，而應(yīng)用抗氧化劑PDTC或NAC則可抑制NFB的激活并同時(shí)抑制細(xì)胞因子及內(nèi)毒素誘導(dǎo)的iNOS mRNA水平及NO的生成。為排除抗氧化劑對(duì)基因表達(dá)的非特異性作用，我們觀察到PDTC或NAC對(duì)GAPDH的組成型表達(dá)并無(wú)明顯影響，且GAPDH基因的5調(diào)控區(qū)并無(wú)NFB的結(jié)合位點(diǎn)，這表明抗氧化劑主要是通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞iNOS基因誘導(dǎo)表達(dá)的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，即抑制NFB的

22、活化而起作用的；并且提示內(nèi)皮細(xì)胞iNOS基因的誘導(dǎo)表達(dá)依賴于NFB的激活。NFB作為一種轉(zhuǎn)錄活化因子，通常以NFB/Rel轉(zhuǎn)錄因子家族的異源二聚體的形式與DNA相結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，其中的NFB1(P50)和RelA(P65)亞單位二聚體為常見(jiàn)。NFB在靜息的內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中與其抑制蛋白(inhibitor of NFB， IB)相結(jié)合。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞激活時(shí)IB被磷酸化進(jìn)而降解使之與NFB二聚體解離，于是活化的P65-P50二聚體迅速由胞漿轉(zhuǎn)位至胞核，與DNA的靶向序列相結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄?？寡趸瘎┛梢砸种芅FB的活化過(guò)程，提示活性氧可能是NFB活化的重要介質(zhì)。NFB可以作為一個(gè)重要的靶分子應(yīng)用于伴有

23、內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度激活的病理過(guò)程如炎癥，動(dòng)脈粥樣硬化，敗血癥等。雖然糖皮質(zhì)激素作為一種常用的抗炎藥物，可以抑制NFB的激活及細(xì)胞促炎分子的表達(dá)9，但糖皮質(zhì)激素的副作用影響了它們的長(zhǎng)期使用?？寡趸瘎┳鳛橐环N小分子化學(xué)物質(zhì)通過(guò)抑制NFB的活化過(guò)程而阻斷細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞因子3、iNOS等分子的基因表達(dá)，因而抗氧化劑可能成為此類疾病的治療中具有應(yīng)用前景的一類藥物。劉清行（上海醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，上海 200032）金惠銘（上海醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，上海 200032）吳朝輝（上海醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，上海 200032）陳愉（上海醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，上海 200032）劉凱（上海醫(yī)科大學(xué)病理生

24、理教研室，上海 200032）參考文獻(xiàn)1Asasa S, Ono S, Seki S, et al. Inhibitory effect of protease inhibitor on endothelial cell activation J. J Surg Res, 1998, 80(2):182190.2Lowenstein CJ, Alley EW, Raval P, et al. Macrophage nitric oxide synthase gene:two upstream regions mediate induction by interferon and lipopol

25、ysaccharide J. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90:97309734.3Ferran C, Millan MT, Csicmadia Vilmos, et al. Inhibition of NFB by pyrolidine dithiocarbamate blocks endothelial cell activation J. Biochem Biophys Res Commun, 1995, 214(1):212223.4劉清行，金惠銘. TNF對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的產(chǎn)生及NOS mRNA表達(dá)的影響J.上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，26(1)：47.5Lee CC, Wu X, Gibbs RA, et al. Generation of cDNA probes directed by amino acid sequence cloning of uratic oxidase J.