平肝潛陽法對高血壓模型大鼠下丘腦蛋白質(zhì)表達的影響

1、平肝潛陽法對高血壓模型大鼠下丘腦蛋白質(zhì)表達的影響         09-02-07 16:27:00     作者：張鶯 陳澤奇 鐘廣偉    編輯：studa20【摘要】  【目的】 觀察平肝潛陽法對高血壓肝陽上亢證模型大鼠下丘腦蛋白質(zhì)表達差異的影響，從蛋白質(zhì)組學(xué)水平探討其降血壓和改善肝陽上亢證癥狀的分子機制?！痉椒ā窟x用自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）灌服附子湯法復(fù)制高血壓肝陽上亢證大鼠模型，以大鼠作正常對照，治療組給予天麻鉤藤

2、飲加減方灌胃給藥（0.1g/mL）；采用二維凝膠電泳（2DE）分離大鼠下丘腦蛋白質(zhì)，獲得差異表達蛋白質(zhì)；利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDITOFMS）和數(shù)據(jù)庫分析鑒定差異表達蛋白質(zhì)。【結(jié)果】 高血壓肝陽上亢證大鼠模型復(fù)制成功，其易激惹程度、飲水量、收縮壓等與正常組比較，差異均有顯著性意義（.）；治療組給予中藥天麻鉤藤飲加減方治療后，易激惹程度好轉(zhuǎn)，飲水量減少，收縮壓下降，與模型組比較差異均有顯著性意義（.）。肝陽上亢模型組蛋白質(zhì)圖譜中有5個蛋白質(zhì)斑點，與正常組比較表達上升2倍及以上，且同一點在平肝潛陽法治療組中表達下降2倍及以上；有10個蛋白質(zhì)斑點表達下降2倍及以上，且同一點在平

3、肝潛陽法治療組中表達上升2倍及以上?！窘Y(jié)論】 平肝潛陽法治療高血壓肝陽上亢證的作用可能與下丘腦某些蛋白質(zhì)的改變有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  高血壓中藥療法 平肝潛陽法 蛋白質(zhì)組學(xué) 疾病模型 動物 大鼠原發(fā)性高血壓?。╡ssential hypertension，EH）是一種常見的心血管系統(tǒng)疾病，具有發(fā)病率高、并發(fā)癥多的特點。流行病學(xué)研究提示人群高血壓病患病率較10年前明顯增高1。長期高血壓病極易導(dǎo)致心、腦、腎等臟器的器質(zhì)性病變和功能損害，并最終導(dǎo)致這些器官的功能衰竭。肝陽上亢證是高血壓病中的常見證型，據(jù)統(tǒng)計在高血壓病中約占 87.33%2。平肝潛陽法是治療高血壓病肝陽上亢證的傳統(tǒng)治法，不僅能

4、有效降低患者的血壓水平，還可改善患者的生存質(zhì)量，降低并發(fā)癥的發(fā)生，已有研究從分子、基因等水平探討其作用機制，取得了有意義的進展3。為了進一步從蛋白質(zhì)水平探討其作用機制，我們應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組技術(shù)，觀察了平肝潛陽法治療高血壓肝陽上亢證大鼠前后下丘腦蛋白質(zhì)表達譜的變化，現(xiàn)報道如下。    1  材料與方法1.1  動物  正常健康Sprague Dawley（SD）雄性大鼠10只，清潔級，8周齡，體質(zhì)量（200±10）g，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物部提供（醫(yī)動字第20010 號）；自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）20只，雄性，清潔級，

5、8周齡，體質(zhì)量（200±10）g，由上海斯萊克公司提供許可證號：SCXK（滬）20030003。1.2  藥物制備  附子湯由 60g 單味制附子（由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院中藥房提供）組成，先將藥物浸泡 30 min，煎煮次后再將藥液合并濃縮為含生藥 0.1 g/mL。天麻鉤藤飲加減方：天麻 10g，鉤藤 20 g，石決明 30 g，牡蠣 30 g，牛膝 10 g，均由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院中藥房提供。石決明先煎 20 min，鉤藤后下，煎煮次后再將藥液合并濃縮為含生藥0.1 g/mL。1.3  主要試劑與儀器  2DQuantKit蛋白質(zhì)定量試劑盒、固相

6、pH梯度干膠條（IPGstrip pH310L，24cm）、IPG Buffer （PH310L）、覆蓋液均由Amershan Biosciences公司提供；二硫蘇糖醇（DTT）、丙烯酰胺、甘氨酸、苯甲基磺酸氟（PMSF）、3（3膽酰胺丙基）二乙胺丙磺酸（CHAPS）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、NNNN四甲基乙二胺（TEMED）、考馬斯亮藍、瓊脂糖均由Sigma公司提供；低分子量標準蛋白質(zhì)由上海伯奧生物制品公司提供；Trisbase為USB公司分裝；碘乙酰胺購自Fluka公司。Ettan IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALTSystem垂直電泳槽（Amersham公司）；PDQue

7、st 7.0分析軟件（BioRad公司）；Imagescanner掃描儀（Sigma公司）；Elx800自動酶標儀（BilTek Instruments，Inc）；真空冷凍抽干儀（avant公司）；4307MALDITOFMS質(zhì)譜儀（ABI公司）；二道生理記錄儀（成都儀器廠）；清醒小動物血壓測量器（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院心臟生理研究室）。1.4  分組與造模  正常組SD大鼠10只；治療組及模型組大鼠各只，完全隨機（隨機排列表法）分組。正常組大鼠連續(xù)灌服蒸餾水 42d，于第 43天處死。治療組及模型組參照鄢東紅等4的方法，連續(xù)灌服附子湯共 21d，復(fù)制高血壓肝陽上亢證模型；自第

8、 22 天起模型組改為連續(xù)灌服蒸餾水 21d，治療組在同一時間灌服天麻鉤藤飲加減方，均于第 43天處死。模型復(fù)制成功的標準參照鄢東紅等4的方法，觀察大鼠的外觀及易激惹程度、飲水量、血壓的變化（造模前，第3周末，第6周末）。血壓測定采用楊綠化等5的尾動脈搏動法。各組動物腹腔注射水合氯醛麻醉，快速斷頭處死，冰上剝離下丘腦，裝在標記好的凍存管后放在液氮中保存?zhèn)溆谩?.5  二維凝膠電泳（2DE）分離和分析1.5.1  蛋白質(zhì)雙向電泳分離  采用2DQuantKit蛋白質(zhì)定量試劑盒的微量測試法測定總蛋白質(zhì)濃度，蛋白質(zhì)定量采用Bradford法6。蛋白質(zhì)雙向電泳參考IPGh

9、orTM等電聚焦系統(tǒng)操作指南進行。參照文獻7進行考馬斯亮藍染色。1.5.2  凝膠圖像分析  采用Image Scanner掃描儀及LabScan掃描軟件進行掃描，獲取圖像。以PDQuest 7.0分析軟件進行圖像分析。參照文獻8，將蛋白質(zhì)表達水平上升或下降200%的點選擇為目標點進行鑒定。1.6  差異蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢測1.6.1  蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶解  切取差異表達蛋白質(zhì)斑點，經(jīng)水洗、脫色處理后，參照Fernandez J等9的方法并加以改進進行蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶解和萃取，獲得蛋白質(zhì)肽混合樣品。1.6.2  基質(zhì)輔助激光解吸

10、電離飛行時間質(zhì)譜 （MALDITOFMS）檢測  肽段樣品采用MALDITOFMS檢測，獲得的混合物肽片段質(zhì)量指紋圖譜在Swissprot數(shù)據(jù)庫搜索進行蛋白鑒定。1.7  統(tǒng)計學(xué)處理  使用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。    2  結(jié)果2.1  大鼠外觀及易激惹程度變化  模型組、治療組大鼠在附子湯灌胃3周后，其易激惹程度發(fā)生了變化，多表現(xiàn)為級，且大部分出現(xiàn)了眼結(jié)合膜充血，與正常組比較，差異有顯著性意義（.）；治療組經(jīng)中藥天麻鉤藤飲加減方治療后（第6周末），其易激惹程度及眼結(jié)合膜充血均較前好轉(zhuǎn)

11、，易激惹程度多表現(xiàn)為、級，眼結(jié)合膜充血大鼠數(shù)亦較前減少，與治療前比較差異均有顯著性意義（.）。結(jié)果見表1。2.2  大鼠飲水量變化  模型組、治療組在附子湯灌胃3周后，飲水量均較造模前增加，與正常組及造模前比較差異有顯著性意義（.）；治療組經(jīng)天麻鉤藤飲加減方治療后，飲水量較治療前及模型組顯著減少（.），與正常組接近（.）。結(jié)果見表2。2.3  大鼠血壓動態(tài)變化  模型組、治療組在附子湯灌胃3周后，其收縮壓均較造模前提高，與造模前及正常組比較差異有顯著性意義（.）；治療組經(jīng)中藥天麻鉤藤飲加減方治療后，收縮壓均較治療前下降，與模型組及治療前比較，差異均有顯著

12、性意義（.）；但與造模前比較，差異無顯著性意義（.）。結(jié)果見表3。2.4  各組大鼠下丘腦蛋白質(zhì)雙向電泳（2DE）圖譜  電泳圖譜經(jīng)考馬斯亮藍染色，Image Scanner掃描后，用PDQuest 7.0分析軟件可以檢測到每組總蛋白質(zhì)分布模式非常相似，且重復(fù)性好，每組約有700個左右的蛋白質(zhì)斑點，以PI 48和Mr 2 00075 000范圍的蛋白質(zhì)斑點分布最多。結(jié)果見圖1。2.5  各組差異表達蛋白  與正常組比較，模型組圖譜中有5個蛋白質(zhì)斑點表達上升2倍及以上，且同一點在治療組中表達下降2倍及以上，大致處于與正常組同一水平，有的點甚至較正常組低2倍

13、或以上；有10個蛋白質(zhì)斑點表達下降2倍及以上，且同一點在治療組中表達上升2倍及以上，大致處于與正常組同一水平，有的點甚至較正常組高2倍或以上。結(jié)果見圖2。2.6  質(zhì)譜結(jié)果  對13個差異顯示蛋白質(zhì)斑點進行膠內(nèi)酶切，MALDITOFMS測定肽質(zhì)量指紋譜，在網(wǎng)站上利用MASCOT軟件檢索Swissprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行鑒定，共鑒定出 8 個蛋白，另外5個蛋白斑點由于沒有得到令人滿意的肽質(zhì)指紋圖譜或搜索數(shù)據(jù)庫時不能得到可信度較高的結(jié)果而未能鑒定。其中細胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶、轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白亞單位同系蛋白、甘油醛3磷酸脫氫酶在模型組表達較正常組上調(diào)，而治療組重新下調(diào)至治療前水平；線粒體異檸

14、檬酸脫氫酶亞單位前體、谷氨酰胺合成酶、蛋白酶體亞單位、磷酸甘油酸變位酶1、果糖二磷酸醛縮酶C在模型組表達較正常組下調(diào)，而治療組重新上調(diào)至治療前水平。    鑒定蛋白相關(guān)信息見表4。    表1  各組大鼠外觀及易激惹程度變化比較（略）Table 1  Comparison of macroscope features and irritation degree in different groups統(tǒng)計方法：t檢驗；.，.，與正常組比較；.，與模型組比較；.，與同組第3周末比較表2   各組大鼠

15、飲水量變化比較（略）Table 2  Comparison of intake water volume in different groups統(tǒng)計方法：t檢驗；.，與正常組比較；.，與模型組比較；.，與造模前比較；.，與同組第3周末比較表3  各組大鼠血壓動態(tài)變化比較（略）Table 3  Comparison of dynamic changes of blood pressure in different groups統(tǒng)計方法：t檢驗；.，與正常組比較；.，與模型組比較；.，與造模前比較；.，與同組第3周末比較表4  治療后差異表達蛋白（略）Table 4  The differential expressed proteins