細(xì)胞活力測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)四細(xì)胞活力測(cè)定MTT法培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定o 1 細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn) 單個(gè)細(xì)胞在體外增殖單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見(jiàn)的克隆?？寺⌒纬陕视脕?lái)的細(xì)胞群體形成肉眼可見(jiàn)的克隆?？寺⌒纬陕视脕?lái)表示細(xì)胞的增殖能力表示細(xì)胞的增殖能力 o 克隆形成率比克隆形成數(shù)接種細(xì)胞數(shù)克隆形成率比克隆形成數(shù)接種細(xì)胞數(shù)o 缺點(diǎn)：操作繁瑣缺點(diǎn)：操作繁瑣o 優(yōu)點(diǎn)：精確、可靠?jī)?yōu)點(diǎn)：精確、可靠2. 化學(xué)染色法化學(xué)染色法o 死細(xì)胞著色法死細(xì)胞著色法（臺(tái)盼藍(lán)、氨基黑、赤蘚紅（臺(tái)盼藍(lán)、氨基黑、赤蘚紅B）、活細(xì)、活細(xì)胞著色法胞著色法（結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、甲

2、苯胺藍(lán)）（結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、甲苯胺藍(lán)）o 臺(tái)盼藍(lán)法臺(tái)盼藍(lán)法o 活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占細(xì)胞活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力中的百分比表示細(xì)胞活力 3. 比色法比色法MTT、XTT、CCK8等等o 四唑鹽（四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)）商品名為噻唑藍(lán) 四吐鹽比色法的原理：活細(xì)胞線粒體中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臜（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值o MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用

3、于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。o操作步驟操作步驟（1）單細(xì)胞懸液接種于）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量孔，每孔培養(yǎng)基總量100-200微微升（各孔保持一致），升（各孔保持一致），37、5CO2培養(yǎng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（待細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期）箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（待細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期）（2）根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤胍欢ㄋ幬锘蛟噭ㄒ话悖└鶕?jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤胍欢ㄋ幬锘蛟噭ㄒ话惚侗认♂尫ㄔO(shè)計(jì)至少倍比稀釋法設(shè)計(jì)至少5個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度度3-5個(gè)復(fù)孔），培養(yǎng)個(gè)復(fù)孔），培養(yǎng)24、48、72h（根（根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件而定）據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條

4、件而定）（3）加入）加入5毫克毫升的毫克毫升的MTT液（液（20微升微升孔）；繼續(xù)培養(yǎng)孔）；繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。小時(shí)。（4）吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入）吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液液（150微升孔），將培養(yǎng)板置于微孔板振微升孔），將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。分鐘，使結(jié)晶物溶解。（5）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值（檢測(cè)波值（檢測(cè)波,490或或570納米），記錄結(jié)果。納米），記錄結(jié)果。經(jīng) 驗(yàn)o接種接種96孔板時(shí)，細(xì)胞一定要混合均勻，每孔加在中間，盡可能不搖孔板時(shí)，細(xì)胞一定要混合均勻，每孔加在中間，盡可能不搖晃，否則液體張力會(huì)讓細(xì)胞移到孔的邊緣，影響生長(zhǎng)?；?，

5、否則液體張力會(huì)讓細(xì)胞移到孔的邊緣，影響生長(zhǎng)。o96孔板四周的孔一般不作為測(cè)量孔?？装逅闹艿目滓话悴蛔鳛闇y(cè)量孔。o一定要有一定要有對(duì)照對(duì)照：o1、空白對(duì)照孔（調(diào)零孔）（培養(yǎng)液、空白對(duì)照孔（調(diào)零孔）（培養(yǎng)液、MTT、DMSO）；）；o2、正常對(duì)照孔（細(xì)胞、培養(yǎng)液、正常對(duì)照孔（細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、DMSO）o可選可選3、陽(yáng)性對(duì)照（細(xì)胞、已知的有明顯作用效果的藥物如順鉑、培、陽(yáng)性對(duì)照（細(xì)胞、已知的有明顯作用效果的藥物如順鉑、培養(yǎng)液、養(yǎng)液、MTT、DMSO ）。）。o可選可選4、陰性對(duì)照（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、陰性對(duì)照（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、DMSO）經(jīng) 驗(yàn)oM

6、TT避光保存，一般可用避光保存，一般可用1-2周周oDMSO 腐蝕微量加樣器，切記注意腐蝕微量加樣器，切記注意o還可用酸化的還可用酸化的10%SDS或或5%異丁醇異丁醇 代替代替DMSOo還原的還原的MTT在在460-630nm均有較好的吸收峰，因此有人用均有較好的吸收峰，因此有人用490、570，也有單波長(zhǎng)雙波長(zhǎng)之分（校正波長(zhǎng)，也有單波長(zhǎng)雙波長(zhǎng)之分（校正波長(zhǎng)630）o在理想的在理想的MTT實(shí)驗(yàn)中，如果是細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)，不加藥物處理組的實(shí)驗(yàn)中，如果是細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)，不加藥物處理組的吸收值應(yīng)該在吸收值應(yīng)該在0.7-1.2左右，太小檢測(cè)誤差占的比例較多，太大吸左右，太小檢測(cè)誤差占的比例較多，太大吸收值可能已經(jīng)超出線性范圍。收值可能已經(jīng)超出線性范圍。 o建議建議CCK-8法替代法替代o可用于求藥物的可用于求藥物的IC50（半抑制率）（半抑制率）實(shí)驗(yàn)步驟o 1、注意實(shí)驗(yàn)過(guò)程的記錄：詳細(xì)o 2、細(xì)胞傳代至96孔板（如培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，可接種密度可選擇103），注意觀察生長(zhǎng)狀態(tài)和加藥時(shí)間.注意：一般加藥前一天換液o 3、加藥。柴胡