細胞工程第二章

1、第二章 細胞全能性第一節(jié) 培養(yǎng)細胞展現(xiàn)生命特征屬性第二節(jié) 脫分化與再分化第一節(jié) 培養(yǎng)細胞展現(xiàn)生命特征屬性1. 細胞全能性的概念2. 植物活細胞具有生命特征屬性3. 離體培養(yǎng)細胞展現(xiàn)該物種的生命特性 一、細胞全能性(cell totipotency)的概念任何具有完整的細胞核的植物細胞，都擁有形成一個完整植株所必需的全部遺傳信息，具有產(chǎn)生完整生物個體的潛在能力，即細胞具有全能性。（一株植株，為什么有的細胞分化成芽、有的分化成根，有的分化成花芽? 某些基因表達） 細胞全能性概念隨著實踐的發(fā)展逐步完善。 1902年，德國植物學家Haberlandt提出了細胞全能性的假想。 1934年，White首次

2、定義為: 每個植物活細胞在合適的條件下，都有發(fā)育為胚的能力。 70年代，擴大了以上定義范圍，認為：植物活細胞不但能形成胚狀體，而且能發(fā)育為完整植株。 80年代初，認為：任何植物的離體細胞在人工培養(yǎng)下都具有它們母體植株的那種合成藥用成分的能力，即培養(yǎng)細胞的藥物生物合成的能力。 目前細胞全能性定義為：每個植物活細胞都具有該物種的新陳代謝、應激性和自體復制等生命基本屬性，在合適的離體培養(yǎng)條件下，可以展現(xiàn)這些特征屬性。二、植物活細胞具有生命特征屬性（一）、生命特征屬性生命特征屬性：新陳代謝、應激性、自我復制。 1. 新陳代謝：是指維持生命各種活動過程中的化學變化的總稱。 生物體總是不斷地從環(huán)境中攝取物

3、質(zhì)和能量，來維持自身。又有同等量的能，以熱或者其他形式排出體外。一旦新陳代謝停止，生命活動也就停止，生物體就會瓦解。 即，生物體要維持生命，必須吐故納新。（如動物）2. 應激性：是指生物體隨環(huán)境變化的刺激而發(fā)生相應反應的特征。 生物體的生存離不開環(huán)境條件，而環(huán)境又是不斷變化的。除四季有規(guī)律的變化外，還有些急劇變化，如干旱、澇災、高溫、低溫、昆蟲侵害等等。生物體具有“某種機制”來感知和正確估計環(huán)境的變化，以便在體內(nèi)加以校正，保證體內(nèi)平衡，來應付突變的環(huán)境。如有些植物種子休眠期很長，可以避開旱、澇、冷、熱等惡劣環(huán)境（如：500年前蓮子發(fā)芽,沙漠綠洲）。有的植物對蟲蛀有應激反應，蟲蛀后，非但不減產(chǎn)，

4、甚至還能增產(chǎn)。變色龍的變色、壁虎的尾巴等。3. 自我復制：是指生物體利用自身作模板，通過代謝作用，復制出完全相同的結(jié)構(gòu)，或產(chǎn)生也具有相同的自體繁殖能力的突變結(jié)構(gòu)。 前者為“遺傳”，后者為“變異”。自我復制實現(xiàn)了遺傳與變異的矛盾統(tǒng)一?！斑z傳”保證了物種的純化，“變異”為物種的進化提供依據(jù)。 自我復制方式因繁殖方式不同而不同。無性繁殖植物通過體細胞分裂即可實現(xiàn)自我復制。 有性繁殖植物自我復制必須通過配子體世代和孢子體世代，即： 細胞分裂 受精卵 組織分化、器官形成減數(shù)分裂精子 性成熟 配子 卵子 合子（受精卵）（二）、細胞具有生命特征屬性 生物體由細胞組成，所以細胞也具有生命特征屬性。 細胞是生物

5、體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。核酸是構(gòu)成細胞的重要物質(zhì)，攜帶著遺傳信息，并具有自我復制的能力，但當單獨存在時，不能表現(xiàn)出生命特征屬性。只有組成細胞時，才能表現(xiàn)完整的生命活動（病毒，核酸必須與蛋白質(zhì)結(jié)合）。 同一個體每一個體細胞所含的基因是相同的，但細胞結(jié)構(gòu)和功能往往不同（如根細胞具有吸收水分和養(yǎng)分的作用；葉片具有光和、蒸騰作用等）。 所以說，并非每個細胞能把全部遺傳信息都表達出來。有的基因在這些細胞中表達，另一些基因在另一些細胞中表達。即，生命的全部屬性在不同的細胞中分別表達。三、離體培養(yǎng)細胞展現(xiàn)該物種的生命特性 （一）、培養(yǎng)細胞的新陳代謝 在適宜條件下，離體細胞能夠存活，則具有新陳代謝特性。如：綠

6、色細胞具有光自養(yǎng)能力；固氮植物細胞具有固氮特性；培養(yǎng)細胞具有該物種的“藥物生物合成的能力” 。（二）、應激性 在適宜培養(yǎng)條件下，離體細胞具有應激性，表現(xiàn)在： 非綠色細胞應變出對培養(yǎng)和環(huán)境的對應方式，以異養(yǎng)方式生存并發(fā)展。依靠培養(yǎng)基供給營養(yǎng)來生存。 植物組織切割損傷后，應激于培養(yǎng)條件而出現(xiàn)脫分化，并在適宜的條件下再分化（芽和根）。（三）、培養(yǎng)細胞展現(xiàn)自體復制特性 脫分化 植物組織 愈傷組織（脫分化細胞） 再分化 植株 脫分化 細胞、原生質(zhì)體 再分化愈傷組織 植株 細胞分裂再分化原生質(zhì)體融合愈傷組織 植株細胞分裂以及植株再生展現(xiàn)了 培養(yǎng)細胞自體復制的特征屬性。 第二節(jié) 脫分化與再分化 脫分化（de

7、differentiation） ：具有特異結(jié)構(gòu)和功能的細胞轉(zhuǎn)化成沒有特異結(jié)構(gòu)和功能的細胞的過程稱為脫分化。（如根、莖、葉） 再分化(redifferentiation) ：是指離體培養(yǎng)物可以由脫分化狀態(tài)再度分化。包括細胞分化、組織分化和器官分化遞進地進行，最后再生完整植株。細胞全能性的表達是通過脫分化和再分化實現(xiàn)的，脫分化是細胞全能性表達的前提，再分化是最終體現(xiàn)。 1. 外植體脫分化2. 愈傷組織的生長3. 細胞分化和組織分化4. 器官分化和植株形成5. 體細胞胚胎發(fā)生一、外植體脫分化外植體：植物組織培養(yǎng)中，把由活性植物上切取下來進行培養(yǎng)的那部分組織或器官叫做外植體。如莖段、根段、葉柄段、葉

8、片、花藥、花粉、幼胚等。脫分化是在啟動分裂的過程中完成的，靜止細胞啟動分裂是分化細胞成功脫分化的標志。 （一）、誘導期間的細胞生物學變化 植物組織從母體上切割下來后，會發(fā)生一系列細胞學及生物化學方面的變化。 靜止細胞：細胞核較小，核位于邊緣，中央有大的液泡，核糖體密度較低，多聚核糖體數(shù)目較少，質(zhì)體分為葉綠體、雜色體、白色體和淀粉體。 1）.細胞結(jié)構(gòu)變化：泡質(zhì)變濃，大液泡消失，核體積增加并移位至中央，細胞器增加，染色體的凝集，線粒體外形及數(shù)量改變等等。泡質(zhì)變濃，和蛋白體的出現(xiàn)被認為是細胞開始脫分化的標志。 。 2）.代謝及生化變化：氣體交換率增加，核糖體出現(xiàn)，RNA積累，DNA合成，有關酶的增加

9、等。脫分化過程被認為可分為3個階段：啟動階段，表現(xiàn)為泡質(zhì)增生，并開始向細胞中央伸出細胞質(zhì)絲，液泡蛋白體出現(xiàn)；演變階段，核向中央移動，質(zhì)體變成原質(zhì)體；脫分化終結(jié)期，回復到分生細胞狀態(tài)，細胞分裂即將開始。（二）、與脫分化有關的因子及其作用 任何具有完整的細胞核的植物細胞，都擁有形成一個完整植株所必需的全部遺傳信息，即細胞具有全能性。這種植物所具有的全能性只是一種可能性，要使這種可能性成為現(xiàn)實性，即使植物細胞、組織或器官離體后，經(jīng)脫分化，形成愈傷組織并再生植株，必須滿足兩個主要條件：一是離體損傷刺激；二是營養(yǎng)物質(zhì)及激素的刺激。除此外，培養(yǎng)溫度、光照等對脫分化也有影響。1. 離體損傷刺激 要使植物組織

10、或細胞經(jīng)脫分化再生植株，必須從植物體其余部分的抑制性影響下解脫出來，即處于離體條件 (正常植株葉片上不會再長植株或愈傷組織)。離體損傷刺激是細胞脫分化的重要條件之一。 損傷刺激會使細胞呼吸速度增大，稱為“損傷呼吸”，酶的活性增加，代謝物含量變化。2生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響 細胞離體后，以異養(yǎng)方式生存，所以必須給與營養(yǎng)物質(zhì)（培養(yǎng)基）。另外，還必須給與激素刺激，以打破抑制力，恢復細胞分裂。 抑制假說認為：靜止細胞仍然保存著在分生組織狀態(tài)時的那種細胞分裂潛能，只不過存在一種抑制物質(zhì)或抑制力，使細胞分裂能力不能表現(xiàn)。如果去除這種抑制，細胞就恢復到分裂狀態(tài)。 這種抑制劑的作用原理及作用位點尚不清楚，但其抑制效

11、應可能會在生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（激素）的作用下而失掉，從而使細胞恢復分裂能力，實現(xiàn)脫分化。 不同植物細胞內(nèi)，抑制劑的質(zhì)和量可能是不同的。因此，在組織培養(yǎng)中，往往因植物不同，培養(yǎng)基中添加激素的種類和濃度以及配比也不同。3光照和溫度的影響 各種植物對光照和溫度的要求不同。有的植物需要在黑暗條件下誘導愈傷組織；但也有的植物在光照條件下誘導愈傷組織，其植株再生率更高。 對溫度的要求，往往耐高溫植物或起源熱帶植物，所需培養(yǎng)溫度較高（如甘薯）；而耐低溫植物，培養(yǎng)溫度較低。一般植物培養(yǎng)溫度在25左右。4培養(yǎng)細胞的異質(zhì)性 在組織培養(yǎng)中，往往某一部分細胞能脫分化，而其它細胞則不能，表現(xiàn)為異質(zhì)性。培養(yǎng)32h的煙草葉片外植

12、體切口部位的半薄切片多數(shù)柵欄細胞已經(jīng)完成第一次分裂，形成兩個子細胞P 柵欄細胞；E 表皮細胞葉肉細胞脫分化第一次有絲分裂過程1-6 柵欄細胞；7-12 海綿細胞由煙草柵欄細胞發(fā)育而成的分生細胞團煙草愈傷組織（黑暗培養(yǎng)）二、愈傷組織的生長 經(jīng)脫分化 導致 細胞具備了分裂能力 結(jié)果細胞不斷增殖愈傷組織的生長 愈傷組織的生長并非一致進行，待細胞分裂到一定時期，便會停止分裂。但如果把處在旺盛生長且未分化的愈傷組織切成小塊進行繼代培養(yǎng)，可維持其活躍生長。利用此特點，進行繼代培養(yǎng)，可大量增殖。 也有例外，有的情況下，組織細胞經(jīng)脫分化后，不形成愈傷組織，而是從脫分化的細胞上直接再分化器官。先形成愈傷組織，再

13、從其上再生植株先形成愈傷組織，再從其上再生植株脫分化細胞直接再生三、細胞分化和組織分化 （一）、細胞分化及其影響因素 細胞分裂分化成什么樣的細胞，是擬分生組織細胞，還是維管組織細胞，或是其它細胞?影響細胞分化的因素： 1. 生長調(diào)節(jié)劑（激素）。培養(yǎng)基中添加生長素、細胞分裂素等的種類、濃度及配比。2. 培養(yǎng)基種類（營養(yǎng)成分）。3. 糖類物質(zhì)。例如培養(yǎng)基中添加蔗糖濃度，過低、過高都不利，一般在2.5%3%比較適宜。4. 其它理化因子。如光照時間、光照強度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH值等。 （二）、組織分化 在細胞分化的基礎上，可以分化出各種各樣的組織。其中，擬分生組織和維管組織是兩種重要的組織。是形成不

14、定芽和不定根的基礎。 擬分生組織：是指培養(yǎng)物中出現(xiàn)的類似分生組織的細胞群，它是脫分化后的培養(yǎng)物發(fā)生一系列細胞分裂而產(chǎn)生的一團小型、薄壁、液泡小的細胞組織。也叫做生長中心或分生組織結(jié)節(jié)。 擬分生組織可以從一個細胞或幾個細胞形成，可以起源于愈傷組織的表面，也可以起源于組織內(nèi)部。 在擬分生組織形成的同時或稍后，愈傷組織中會分化出維管組織結(jié)節(jié)。 維管組織結(jié)節(jié)：是指一個區(qū)域的愈傷組織轉(zhuǎn)化為韌皮分子和木質(zhì)分子的混合結(jié)構(gòu)（類似形成層）。 這種形成層狀的細胞向外延伸與擬分生組織連接，形成芽原基或根原基。 四、器官分化和植株形成 脫分化組織（細胞）形成愈傷組織細胞分化組織分化（擬分生組織和維管組織節(jié)結(jié)）器官分化

15、（芽和根）植株形成 （一）、器官分化 器官分化主要指根和芽的分化。是否能夠發(fā)生器官分化，與前培養(yǎng)有關，如脫分化、細胞分化、組織分化等。有了前邊這些分化才會有器官分化。（二）、完整植株的形成植株再生途徑外植體脫分化愈傷組織或脫分化細胞完整植株體細胞胚不定器官 到底通過哪個途徑再生，取決于培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基，尤其培養(yǎng)基中添加激素的種類、濃度及配比。 除上述之外，還有兩種情況，不經(jīng)脫分化而直接長成植株： 直接伸長莖尖培養(yǎng)（較大時）完整植株 發(fā)育幼胚培養(yǎng)（較大時）完整植株體細胞胚（Somatic embryo）的發(fā)生來源 1外植體細胞經(jīng)脫分化后直接產(chǎn)生體胚 似種子胚發(fā)育過程。首先脫分化細胞經(jīng)不等分裂，產(chǎn)生一個胚柄細胞和一個胚細胞，前者發(fā)育為類似胚柄，后者進一步分裂發(fā)育為球狀胚 心形胚 魚雷胚 子葉胚 成熟胚。五、體細胞胚胎發(fā)生石龍芮試管植株莖表皮產(chǎn)生的胚狀體葡萄葉片外植體產(chǎn)生的胚狀體A 成熟胚狀體；b,c 再生植株2由胚性愈傷組織產(chǎn)生胚狀體 胚性愈傷組織的表面是高度分生組織化的細胞團，其表面可以產(chǎn)生大量的胚狀體。 一般培養(yǎng)過程：胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基 體細胞胚誘導培養(yǎng)基 體細胞胚發(fā)芽培養(yǎng)基 但也有的情況下，在胚性愈傷組織培養(yǎng)基上可以直接形成