細(xì)胞工程第二章

1、第二章 細(xì)胞全能性第一節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞展現(xiàn)生命特征屬性第二節(jié) 脫分化與再分化第一節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞展現(xiàn)生命特征屬性1. 細(xì)胞全能性的概念2. 植物活細(xì)胞具有生命特征屬性3. 離體培養(yǎng)細(xì)胞展現(xiàn)該物種的生命特性 一、細(xì)胞全能性(cell totipotency)的概念任何具有完整的細(xì)胞核的植物細(xì)胞，都擁有形成一個(gè)完整植株所必需的全部遺傳信息，具有產(chǎn)生完整生物個(gè)體的潛在能力，即細(xì)胞具有全能性。（一株植株，為什么有的細(xì)胞分化成芽、有的分化成根，有的分化成花芽? 某些基因表達(dá)） 細(xì)胞全能性概念隨著實(shí)踐的發(fā)展逐步完善。 1902年，德國植物學(xué)家Haberlandt提出了細(xì)胞全能性的假想。 1934年，White首次

2、定義為: 每個(gè)植物活細(xì)胞在合適的條件下，都有發(fā)育為胚的能力。 70年代，擴(kuò)大了以上定義范圍，認(rèn)為：植物活細(xì)胞不但能形成胚狀體，而且能發(fā)育為完整植株。 80年代初，認(rèn)為：任何植物的離體細(xì)胞在人工培養(yǎng)下都具有它們母體植株的那種合成藥用成分的能力，即培養(yǎng)細(xì)胞的藥物生物合成的能力。 目前細(xì)胞全能性定義為：每個(gè)植物活細(xì)胞都具有該物種的新陳代謝、應(yīng)激性和自體復(fù)制等生命基本屬性，在合適的離體培養(yǎng)條件下，可以展現(xiàn)這些特征屬性。二、植物活細(xì)胞具有生命特征屬性（一）、生命特征屬性生命特征屬性：新陳代謝、應(yīng)激性、自我復(fù)制。 1. 新陳代謝：是指維持生命各種活動(dòng)過程中的化學(xué)變化的總稱。 生物體總是不斷地從環(huán)境中攝取物

3、質(zhì)和能量，來維持自身。又有同等量的能，以熱或者其他形式排出體外。一旦新陳代謝停止，生命活動(dòng)也就停止，生物體就會(huì)瓦解。 即，生物體要維持生命，必須吐故納新。（如動(dòng)物）2. 應(yīng)激性：是指生物體隨環(huán)境變化的刺激而發(fā)生相應(yīng)反應(yīng)的特征。 生物體的生存離不開環(huán)境條件，而環(huán)境又是不斷變化的。除四季有規(guī)律的變化外，還有些急劇變化，如干旱、澇災(zāi)、高溫、低溫、昆蟲侵害等等。生物體具有“某種機(jī)制”來感知和正確估計(jì)環(huán)境的變化，以便在體內(nèi)加以校正，保證體內(nèi)平衡，來應(yīng)付突變的環(huán)境。如有些植物種子休眠期很長，可以避開旱、澇、冷、熱等惡劣環(huán)境（如：500年前蓮子發(fā)芽,沙漠綠洲）。有的植物對蟲蛀有應(yīng)激反應(yīng)，蟲蛀后，非但不減產(chǎn)，

4、甚至還能增產(chǎn)。變色龍的變色、壁虎的尾巴等。3. 自我復(fù)制：是指生物體利用自身作模板，通過代謝作用，復(fù)制出完全相同的結(jié)構(gòu)，或產(chǎn)生也具有相同的自體繁殖能力的突變結(jié)構(gòu)。 前者為“遺傳”，后者為“變異”。自我復(fù)制實(shí)現(xiàn)了遺傳與變異的矛盾統(tǒng)一?！斑z傳”保證了物種的純化，“變異”為物種的進(jìn)化提供依據(jù)。 自我復(fù)制方式因繁殖方式不同而不同。無性繁殖植物通過體細(xì)胞分裂即可實(shí)現(xiàn)自我復(fù)制。 有性繁殖植物自我復(fù)制必須通過配子體世代和孢子體世代，即： 細(xì)胞分裂 受精卵 組織分化、器官形成減數(shù)分裂精子 性成熟 配子 卵子 合子（受精卵）（二）、細(xì)胞具有生命特征屬性 生物體由細(xì)胞組成，所以細(xì)胞也具有生命特征屬性。 細(xì)胞是生物

5、體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。核酸是構(gòu)成細(xì)胞的重要物質(zhì)，攜帶著遺傳信息，并具有自我復(fù)制的能力，但當(dāng)單獨(dú)存在時(shí)，不能表現(xiàn)出生命特征屬性。只有組成細(xì)胞時(shí)，才能表現(xiàn)完整的生命活動(dòng)（病毒，核酸必須與蛋白質(zhì)結(jié)合）。 同一個(gè)體每一個(gè)體細(xì)胞所含的基因是相同的，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能往往不同（如根細(xì)胞具有吸收水分和養(yǎng)分的作用；葉片具有光和、蒸騰作用等）。 所以說，并非每個(gè)細(xì)胞能把全部遺傳信息都表達(dá)出來。有的基因在這些細(xì)胞中表達(dá)，另一些基因在另一些細(xì)胞中表達(dá)。即，生命的全部屬性在不同的細(xì)胞中分別表達(dá)。三、離體培養(yǎng)細(xì)胞展現(xiàn)該物種的生命特性 （一）、培養(yǎng)細(xì)胞的新陳代謝 在適宜條件下，離體細(xì)胞能夠存活，則具有新陳代謝特性。如：綠

6、色細(xì)胞具有光自養(yǎng)能力；固氮植物細(xì)胞具有固氮特性；培養(yǎng)細(xì)胞具有該物種的“藥物生物合成的能力” 。（二）、應(yīng)激性 在適宜培養(yǎng)條件下，離體細(xì)胞具有應(yīng)激性，表現(xiàn)在： 非綠色細(xì)胞應(yīng)變出對培養(yǎng)和環(huán)境的對應(yīng)方式，以異養(yǎng)方式生存并發(fā)展。依靠培養(yǎng)基供給營養(yǎng)來生存。 植物組織切割損傷后，應(yīng)激于培養(yǎng)條件而出現(xiàn)脫分化，并在適宜的條件下再分化（芽和根）。（三）、培養(yǎng)細(xì)胞展現(xiàn)自體復(fù)制特性 脫分化 植物組織 愈傷組織（脫分化細(xì)胞） 再分化 植株 脫分化 細(xì)胞、原生質(zhì)體 再分化愈傷組織 植株 細(xì)胞分裂再分化原生質(zhì)體融合愈傷組織 植株細(xì)胞分裂以及植株再生展現(xiàn)了 培養(yǎng)細(xì)胞自體復(fù)制的特征屬性。 第二節(jié) 脫分化與再分化 脫分化（de

7、differentiation） ：具有特異結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞轉(zhuǎn)化成沒有特異結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞的過程稱為脫分化。（如根、莖、葉） 再分化(redifferentiation) ：是指離體培養(yǎng)物可以由脫分化狀態(tài)再度分化。包括細(xì)胞分化、組織分化和器官分化遞進(jìn)地進(jìn)行，最后再生完整植株。細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過脫分化和再分化實(shí)現(xiàn)的，脫分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的前提，再分化是最終體現(xiàn)。 1. 外植體脫分化2. 愈傷組織的生長3. 細(xì)胞分化和組織分化4. 器官分化和植株形成5. 體細(xì)胞胚胎發(fā)生一、外植體脫分化外植體：植物組織培養(yǎng)中，把由活性植物上切取下來進(jìn)行培養(yǎng)的那部分組織或器官叫做外植體。如莖段、根段、葉柄段、葉

8、片、花藥、花粉、幼胚等。脫分化是在啟動(dòng)分裂的過程中完成的，靜止細(xì)胞啟動(dòng)分裂是分化細(xì)胞成功脫分化的標(biāo)志。 （一）、誘導(dǎo)期間的細(xì)胞生物學(xué)變化 植物組織從母體上切割下來后，會(huì)發(fā)生一系列細(xì)胞學(xué)及生物化學(xué)方面的變化。 靜止細(xì)胞：細(xì)胞核較小，核位于邊緣，中央有大的液泡，核糖體密度較低，多聚核糖體數(shù)目較少，質(zhì)體分為葉綠體、雜色體、白色體和淀粉體。 1）.細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化：泡質(zhì)變濃，大液泡消失，核體積增加并移位至中央，細(xì)胞器增加，染色體的凝集，線粒體外形及數(shù)量改變等等。泡質(zhì)變濃，和蛋白體的出現(xiàn)被認(rèn)為是細(xì)胞開始脫分化的標(biāo)志。 。 2）.代謝及生化變化：氣體交換率增加，核糖體出現(xiàn)，RNA積累，DNA合成，有關(guān)酶的增加

9、等。脫分化過程被認(rèn)為可分為3個(gè)階段：啟動(dòng)階段，表現(xiàn)為泡質(zhì)增生，并開始向細(xì)胞中央伸出細(xì)胞質(zhì)絲，液泡蛋白體出現(xiàn)；演變階段，核向中央移動(dòng)，質(zhì)體變成原質(zhì)體；脫分化終結(jié)期，回復(fù)到分生細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞分裂即將開始。（二）、與脫分化有關(guān)的因子及其作用 任何具有完整的細(xì)胞核的植物細(xì)胞，都擁有形成一個(gè)完整植株所必需的全部遺傳信息，即細(xì)胞具有全能性。這種植物所具有的全能性只是一種可能性，要使這種可能性成為現(xiàn)實(shí)性，即使植物細(xì)胞、組織或器官離體后，經(jīng)脫分化，形成愈傷組織并再生植株，必須滿足兩個(gè)主要條件：一是離體損傷刺激；二是營養(yǎng)物質(zhì)及激素的刺激。除此外，培養(yǎng)溫度、光照等對脫分化也有影響。1. 離體損傷刺激 要使植物組織

10、或細(xì)胞經(jīng)脫分化再生植株，必須從植物體其余部分的抑制性影響下解脫出來，即處于離體條件 (正常植株葉片上不會(huì)再長植株或愈傷組織)。離體損傷刺激是細(xì)胞脫分化的重要條件之一。 損傷刺激會(huì)使細(xì)胞呼吸速度增大，稱為“損傷呼吸”，酶的活性增加，代謝物含量變化。2生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響 細(xì)胞離體后，以異養(yǎng)方式生存，所以必須給與營養(yǎng)物質(zhì)（培養(yǎng)基）。另外，還必須給與激素刺激，以打破抑制力，恢復(fù)細(xì)胞分裂。 抑制假說認(rèn)為：靜止細(xì)胞仍然保存著在分生組織狀態(tài)時(shí)的那種細(xì)胞分裂潛能，只不過存在一種抑制物質(zhì)或抑制力，使細(xì)胞分裂能力不能表現(xiàn)。如果去除這種抑制，細(xì)胞就恢復(fù)到分裂狀態(tài)。 這種抑制劑的作用原理及作用位點(diǎn)尚不清楚，但其抑制效

11、應(yīng)可能會(huì)在生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（激素）的作用下而失掉，從而使細(xì)胞恢復(fù)分裂能力，實(shí)現(xiàn)脫分化。 不同植物細(xì)胞內(nèi)，抑制劑的質(zhì)和量可能是不同的。因此，在組織培養(yǎng)中，往往因植物不同，培養(yǎng)基中添加激素的種類和濃度以及配比也不同。3光照和溫度的影響 各種植物對光照和溫度的要求不同。有的植物需要在黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織；但也有的植物在光照條件下誘導(dǎo)愈傷組織，其植株再生率更高。 對溫度的要求，往往耐高溫植物或起源熱帶植物，所需培養(yǎng)溫度較高（如甘薯）；而耐低溫植物，培養(yǎng)溫度較低。一般植物培養(yǎng)溫度在25左右。4培養(yǎng)細(xì)胞的異質(zhì)性 在組織培養(yǎng)中，往往某一部分細(xì)胞能脫分化，而其它細(xì)胞則不能，表現(xiàn)為異質(zhì)性。培養(yǎng)32h的煙草葉片外植

12、體切口部位的半薄切片多數(shù)柵欄細(xì)胞已經(jīng)完成第一次分裂，形成兩個(gè)子細(xì)胞P 柵欄細(xì)胞；E 表皮細(xì)胞葉肉細(xì)胞脫分化第一次有絲分裂過程1-6 柵欄細(xì)胞；7-12 海綿細(xì)胞由煙草柵欄細(xì)胞發(fā)育而成的分生細(xì)胞團(tuán)煙草愈傷組織（黑暗培養(yǎng)）二、愈傷組織的生長 經(jīng)脫分化 導(dǎo)致 細(xì)胞具備了分裂能力 結(jié)果細(xì)胞不斷增殖愈傷組織的生長 愈傷組織的生長并非一致進(jìn)行，待細(xì)胞分裂到一定時(shí)期，便會(huì)停止分裂。但如果把處在旺盛生長且未分化的愈傷組織切成小塊進(jìn)行繼代培養(yǎng)，可維持其活躍生長。利用此特點(diǎn)，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，可大量增殖。 也有例外，有的情況下，組織細(xì)胞經(jīng)脫分化后，不形成愈傷組織，而是從脫分化的細(xì)胞上直接再分化器官。先形成愈傷組織，再

13、從其上再生植株先形成愈傷組織，再從其上再生植株脫分化細(xì)胞直接再生三、細(xì)胞分化和組織分化 （一）、細(xì)胞分化及其影響因素 細(xì)胞分裂分化成什么樣的細(xì)胞，是擬分生組織細(xì)胞，還是維管組織細(xì)胞，或是其它細(xì)胞?影響細(xì)胞分化的因素： 1. 生長調(diào)節(jié)劑（激素）。培養(yǎng)基中添加生長素、細(xì)胞分裂素等的種類、濃度及配比。2. 培養(yǎng)基種類（營養(yǎng)成分）。3. 糖類物質(zhì)。例如培養(yǎng)基中添加蔗糖濃度，過低、過高都不利，一般在2.5%3%比較適宜。4. 其它理化因子。如光照時(shí)間、光照強(qiáng)度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH值等。 （二）、組織分化 在細(xì)胞分化的基礎(chǔ)上，可以分化出各種各樣的組織。其中，擬分生組織和維管組織是兩種重要的組織。是形成不

14、定芽和不定根的基礎(chǔ)。 擬分生組織：是指培養(yǎng)物中出現(xiàn)的類似分生組織的細(xì)胞群，它是脫分化后的培養(yǎng)物發(fā)生一系列細(xì)胞分裂而產(chǎn)生的一團(tuán)小型、薄壁、液泡小的細(xì)胞組織。也叫做生長中心或分生組織結(jié)節(jié)。 擬分生組織可以從一個(gè)細(xì)胞或幾個(gè)細(xì)胞形成，可以起源于愈傷組織的表面，也可以起源于組織內(nèi)部。 在擬分生組織形成的同時(shí)或稍后，愈傷組織中會(huì)分化出維管組織結(jié)節(jié)。 維管組織結(jié)節(jié)：是指一個(gè)區(qū)域的愈傷組織轉(zhuǎn)化為韌皮分子和木質(zhì)分子的混合結(jié)構(gòu)（類似形成層）。 這種形成層狀的細(xì)胞向外延伸與擬分生組織連接，形成芽原基或根原基。 四、器官分化和植株形成 脫分化組織（細(xì)胞）形成愈傷組織細(xì)胞分化組織分化（擬分生組織和維管組織節(jié)結(jié)）器官分化

15、（芽和根）植株形成 （一）、器官分化 器官分化主要指根和芽的分化。是否能夠發(fā)生器官分化，與前培養(yǎng)有關(guān)，如脫分化、細(xì)胞分化、組織分化等。有了前邊這些分化才會(huì)有器官分化。（二）、完整植株的形成植株再生途徑外植體脫分化愈傷組織或脫分化細(xì)胞完整植株體細(xì)胞胚不定器官 到底通過哪個(gè)途徑再生，取決于培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基，尤其培養(yǎng)基中添加激素的種類、濃度及配比。 除上述之外，還有兩種情況，不經(jīng)脫分化而直接長成植株： 直接伸長莖尖培養(yǎng)（較大時(shí)）完整植株 發(fā)育幼胚培養(yǎng)（較大時(shí)）完整植株體細(xì)胞胚（Somatic embryo）的發(fā)生來源 1外植體細(xì)胞經(jīng)脫分化后直接產(chǎn)生體胚 似種子胚發(fā)育過程。首先脫分化細(xì)胞經(jīng)不等分裂，產(chǎn)生一個(gè)胚柄細(xì)胞和一個(gè)胚細(xì)胞，前者發(fā)育為類似胚柄，后者進(jìn)一步分裂發(fā)育為球狀胚 心形胚 魚雷胚 子葉胚 成熟胚。五、體細(xì)胞胚胎發(fā)生石龍芮試管植株莖表皮產(chǎn)生的胚狀體葡萄葉片外植體產(chǎn)生的胚狀體A 成熟胚狀體；b,c 再生植株2由胚性愈傷組織產(chǎn)生胚狀體 胚性愈傷組織的表面是高度分生組織化的細(xì)胞團(tuán)，其表面可以產(chǎn)生大量的胚狀體。 一般培養(yǎng)過程：胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基 體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基 體細(xì)胞胚發(fā)芽培養(yǎng)基 但也有的情況下，在胚性愈傷組織培養(yǎng)基上可以直接形成