堿性磷酸酶的分離純化與酶學性質研究

1、堿性磷酸酶的分離純化與酶學性質研究董靜 201131301031摘要:以豬肝為原料,采用低濃度醋酸鈉(低滲破膜作用制備肝勻漿,醋酸鎂則有保護和穩(wěn)定AKP 的作用,勻漿中加入正丁醇可使部分雜蛋白變性,釋出膜中酶,過濾后,以去除雜蛋白。含有AKP 的濾液用冷丙酮和冷乙酸進行重復分離純化。根據(jù)AKP 在33%的丙酮或30%的乙醇中溶解,而在50%的丙酮或60%的乙酸中不溶解的性質,用冷丙酮和冷乙醇重復分離提取,可從含有AKP 的濾液中獲得較為純凈的堿性磷酸酶。酶學性質研究表明該酶催化對磷酸苯二鈉水解反應的最適PH值為10.0,最適溫度為37,米氏常數(shù)值Km為3.154mmol/L,酶的熱穩(wěn)定性研究表

2、明該酶在pH在8-9區(qū)間和溫度在25-37區(qū)間下穩(wěn)定。關鍵字:堿性磷酸酶分離純化熱穩(wěn)定性酸堿穩(wěn)定性堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase,EC3.1.3.1,簡稱AKP廣泛存在于微生物界和動物界,它在動物機體的骨化過程中及在磷化物和其他一些營養(yǎng)物質的消化、吸收和轉運過程中起著重要作用。此外,通過催化磷蛋白的水解,堿性磷酸酶在細胞調(diào)節(jié)過程中也具有一定的作用。它可專一性的水解磷酸單酯化合物而釋放無機磷,主要用于核酸研究,分析、測定核苷酸順序及其基團的重組、分離,也是酶標免疫測定技術的常用工具酶之一。藥用化妝品中添加堿性磷酸酶有益于皮膚細胞的再生和新陳代謝,還可用于核苷酸脫磷產(chǎn)生核苷等。

3、它是一種膜結合蛋白,在生物體內(nèi)直接參與磷酸基團的轉移和代謝等生理過程1。臨床上通過測定AKP的活力,可作為診斷骨骼及肝臟疾病的重要生化指標。因此純化和研究AKP的性質、調(diào)控等有重要意義。本實驗嘗試以豬肝為材料,分離純化豬肝堿性磷酸酶,研究其酶學性質,旨在探討以豬肝研制科研用堿性磷酸酶生化試劑的方法,同時也為進一步的深入研究該酶提供理論上的參考。此外,豬肝來源廣泛,價格便宜,可以作為生產(chǎn)堿性磷酸酶生化試劑的原料2-3。研究酶的生物學特性,其之一是它對酸堿度的敏感性, pH對酶活性的影響極為顯著,通常各種酶只有在一定的范圍內(nèi)才表現(xiàn)出活性,同一種酶在不同的pH條件下所表現(xiàn)的活性不同,其表現(xiàn)活性最高時

4、的pH值稱為酶的最適pH。pH 不僅對酶活性有很大影響,而且對酶的穩(wěn)定性也有很大的影響,而且對酶的穩(wěn)定性也有很大的影響。因為該酶的化學本質是蛋白質,同蛋白質容易變性一樣,酶在過酸或過堿的條件下也很容易變性失活。各種酶的酸堿度穩(wěn)定范圍是不同的,這就需要制作酸堿穩(wěn)定性曲線4。對溫度的敏感性是酶的又一個重要特性。酶反應速度達到最大值時的溫度稱為酶的最適溫度。如果保持其它反應條件恒定,而在一系列變化的溫度條件下測定酶活力,以溫度為橫坐標,反應速度為縱坐標,可得到一條溫度酶活性曲線。酶的種類和來源不同,對熱的穩(wěn)定性也不同,這就需要通過熱穩(wěn)定性試驗測出熱穩(wěn)定范圍。一般的試驗方法是在一定條件下先將酶在不同的

5、溫度下處理一段時間,迅速降溫,然后再在一定溫度條件下測定酶活力。以處理溫度為橫坐標,酶反應速度為縱坐標作圖,可得到酶的熱穩(wěn)定性曲線,根據(jù)這條曲線即可求出酶的熱穩(wěn)定性范圍5。抑制劑是引起酶促反應速度降低的一類物質的統(tǒng)稱。它與酶的活性部位結合,改變了酶活性部位的結構或性質,從而引起酶活力下降,這里不包括酶蛋白的水解或變性等情況。在可逆抑制類型中,根據(jù)抑制劑、底物和酶三者的相互關系,又可分為競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制三種。在競爭性抑制中,酶不能同時和底物、抑制劑結合,即不能形成EIS,其動力學特征是:米氏常數(shù)的表觀值Km增加,酶的最大反應速度Vm不變。在非競爭性抑制中,抑制劑、底物都能同

6、時和酶結合形成EIS,但是EIS不能進一步轉變?yōu)楫a(chǎn)物,其動力學特征是: Vm降低而Km不變。在反競爭性抑制中,抑制劑必須在酶和底物結合以后才能和酶結合形成EIS,即Ki=,其動力學特征是:Km和Vm都發(fā)生了變化6。1 材料與方法1.1材料1.1.1原料菜市場購買的新鮮豬肝,由本實驗室保存。1.1.2 主要儀器移液管;量筒;玻璃勺漿器(管;剪刀;離心機(湘儀Cence H2050R 為湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公產(chǎn)品;新華定性濾紙;HH 數(shù)顯恒溫水浴鍋為金壇市金城國勝實驗儀器產(chǎn)品;721型分光光度計(UNIC7200 SPECTROPHOTOMETER 為國產(chǎn)分光光度計。1.1.3 試劑0.5m

7、ol/L 醋酸鎂溶液:107.25g 醋酸鎂溶于蒸餾水中,定容至1000ml;0.1mol/L 酸鈉溶液:8.2g 醋酸鈉溶于蒸餾水中,定容至1000ml;0.01mol/L 醋酸鎂-0.0lmol/L 醋酸鈉溶液:準確吸取20ml0.5mol/L 醋酸鎂溶100ml0.14mol/L 醋酸鈉溶液,混合后定容至1000ml ;tris-hcl ph8.8緩沖液:稱取三羥甲基氨基甲烷12.1g ,用蒸餾水溶解后定容至1000ml ,即為0.1mol/LTris 溶液.取100ml10.1mol/LTris 溶液,加蒸餾水約780mL ,再加0.1mol/L 醋酸鎂溶液100ml ,混勻后用1%冰

8、醋酸調(diào)ph 為8.8,用蒸餾水定容至1000ml ;正丁醇、丙酮、95%乙醇;0.04mol/l 作用物液:稱取10.16g 磷酸苯二鈉,用煮沸后冷卻的蒸餾水溶解,并稀釋至1000ml ,加4ml 氯仿防腐,貯于棕色瓶子內(nèi),置冰箱內(nèi)保存;0.1mol/l 碳酸鹽緩沖液(ph10.0:稱取無水碳酸鈉6.36g 及碳酸氫鈉3.36g 溶解于蒸餾水中,并稀釋至1000ml ;堿性磷酸酶液:取純化的堿性磷酸酶5mg ,用ph10緩沖液配制成100ml ,放置冰箱內(nèi)保存;0.5mol/lNaOH 溶液;100.3%4-氨基安替比林:稱取3g4-氨替比林及碳酸氫鈉42g ,用蒸餾水溶解,并稀釋至1000m

9、l ,貯于棕色瓶中,放冰箱內(nèi)保存;11 0.5%鐵氰化鉀:稱取10g 鐵氰化鉀及30g 硼酸各溶于800ml 蒸餾水中,溶解后兩液混合加水至2000ml 。置棕色瓶中,放冰箱內(nèi)保存;12基質液:稱取磷酸苯二鈉2H 2O6g,4-氨基安替比林3g ,分別溶于煮沸冷卻后的蒸餾水中,兩液混合并稀釋至1000ml ,加4ml 氯仿防腐,于棕色瓶內(nèi),用時與等量的水混合即可;13各ph 值相應緩沖液,140.5mol/LKH 2PO 4:稱取KH 2PO 46.80g ,加水溶解并定容至100ml ;150.04M 磷酸氫二鈉:稱取磷酸氫二鈉14.3g ,溶解于0.1MpH10的碳酸緩沖液中,并用此液稀釋

10、至1000ml 。1.2 方法1.2.1 提取方法加10ml正丁醇,攪拌3-5分鐘后,四層紗布過濾后,離心30min,2500r/min加23.5ml冷丙酮(-10混勻,冰凍離心2500轉5分鐘 加0.5moL/l醋酸鎂20ml,量體積為29ml加96%乙醇12,95ml離心3000轉5分鐘 加96%乙醇27.9ml,離心2500轉5分鐘0.01mol/L醋酸鎂-0.0lmol/L醋酸鈉20ml溶解,加96%乙醇9.75ml,離心2500轉5分鐘加96%乙醇24.5ml,離心2500轉5分鐘分離純化堿性磷酸酶的操作流程如下(以下操作均在0-4進行取新鮮豬肝10g剪碎(0-4肝勻漿體積32.5m

11、l濾液23,5ml上清液(棄去沉淀懸液沉淀(棄去上清液33.5ml上清液(棄去沉淀上清液29.5ml加0.01mol/L醋酸鎂-0.0lmol/L醋酸鈉60ml,在電動勻漿上勻漿。加0.5mol/L 磷酸鎂15ml 溶解,總體積17.5ml ,加99.5%丙酮16.4ml ,離心2500轉5分鐘 加丙酮7.65ml 至50%,離心4000轉10分鐘 上清液(棄去沉淀沉淀(棄去 上清液上清液(棄去沉淀:加pH8.8Tris 緩沖液10ml ,分裝保存,1ml1管,在-20下保存10管。1.2.2 Km 值測定方法取大試管7支,按表1分別加入相應試劑,加入酶液,混勻之后立即計時,各管在37水浴中準

12、確保溫15分鐘后,立即加入0.5molNaOH 液1.0ml 以終止反應;各管中加入0.3%4-氨基安替比林1.0ml 和0.5%鐵氰化鉀2.0ml ,充分混勻,放置10分鐘,以0管為對照,在波長510nm 下比色,記錄各管的吸光度;作圖:所測各管的吸光度代表各管中反應速度v ,以之為縱軸,以作用物濃度S為橫軸,在坐標紙上連接各點作圖,以觀察曲線的形狀。以各管吸光度值的倒數(shù)為縱坐標軸,以作用物濃度的倒數(shù)為橫坐標,作圖并求出此酶的Km 值。表1 Km 值測定曲線制作試劑管號 (ml 1 2 3 45 6 7 0 液pH10磷酸緩沖液0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.

13、90 0.90 蒸餾水0.85 0.80 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 0 混勻 37 預熱 5分鐘1.2.3 最適pH及酸堿穩(wěn)定性實驗pH活性曲線的制作取6支試管,按表2操作,以反應pH值為橫坐標,A510為縱坐標繪制pH 活性曲線,求出堿性磷酸酶在本實驗條件下的最適pH值。表2 pH活性曲線制作管號 1 2 3 4 5 0反應pH 8 9 10 11 12 10相應pH緩沖液各加0.5ml酶液各加0.1ml(0號管酶液在鐵氰化鉀之后加/37預熱5分鐘預熱的基質液各加3.0ml37精確保溫15min后各加1,0ml堿性溶液終止反應0.5%鐵氰化鉀各加2.0mlA510酸堿

14、穩(wěn)定范圍的測定為縱坐標,繪制酸堿穩(wěn)定曲取6支試管,按表3操作,以pH為橫坐標,A510線,并分析堿性磷酸酶的酸堿穩(wěn)定范圍。表3 酸堿穩(wěn)定范圍曲線的制作管號 1 2 3 4 5 0處理pH 8 9 10 11 12 10 相應pH緩沖液各加0.1ml酶液各加0.1ml37保溫處理1h0.1MPH10碳酸鹽緩沖液各加0.5ml預熱的基質液各加3.0ml(0號管基質液在鐵氰化鉀之后加0.5%鐵氰化鉀各加0.2mlA5101.2.4 最適溫度及熱穩(wěn)定性實驗溫度活性曲線的制作取4支試管,按表4操作,以反應溫度為橫坐標,A為縱坐標,繪制溫度510活性曲線圖,求出堿性磷酸酶在本實驗條件下的最適溫度。表4 溫

15、度活性曲線制作管號 1 2 3 0反應溫度(25 37 80 37稀釋酶液各加0.1ml(0號管在鐵氰化鉀之后加預熱復合基質液各加3.0ml分別在不同溫度下精確反應15min,各加1.0ml堿性溶液終止反應各加0.5%鐵氰化鉀2.0ml,靜置10minA510熱穩(wěn)定性測定取4支試管,按表5操作,在上述相應溫度的恒溫水浴鍋內(nèi)放置相應時間后取出,立即以流動水冷卻并置于37恒溫水浴鍋中預熱2分鐘,以處理溫度為為縱坐標,繪制處理時間為15min的熱穩(wěn)定曲線,并分析在本實驗橫坐標,A510條件下堿性磷酸酶的熱穩(wěn)定范圍。表5 熱穩(wěn)定范圍曲線制作管號 1 2 3 0熱處理溫度(25 37 80 25熱處理時

16、間(分各15酶液(ml各加0.1ml(0號管在鐵氰化鉀之后加37預熱的復合基質各加3.0ml37精確反應15min后各加1,0ml堿性溶液終止反應0.5%鐵氰化鉀各加0.2mlA5101.2.5 抑制劑類型鑒別取5支試管,按表6操作,以反應速度倒數(shù)1/V或1/ A510為縱坐標,以底物濃度倒數(shù)1/S為橫坐標,作圖,觀察直線在縱軸和橫軸上的交點位置并計算其K值,與未加抑制時的Km值比較。說明該抑制劑屬于何種類型。表6 抑制劑類型曲線制作管號 1 2 3 4 040mmol./L底物濃度0.10 0.15 0.20 0.30 0碳酸鹽緩沖液0.9 0.9 0.9 0.9 0.9蒸餾水0.80 0.

17、75 0.70 0.60 0.900.25MKH2PO40.1 0.1 0.1 0.1 0.1混勻,37預熱5min酶液0.1 0.1 0.1 0.1 0.1最終底物濃度(mmol/L0.1 0.1 0.1 0.1 0.1按順序各加1.0ml堿性溶液,1ml4-氨基安替比林,2ml鐵氰化鉀A5102. 結果與分析2.1 Km值的測定表7 Km值測定實驗各管光吸收值管號 1 2 3 4 5 6 7 0 0.04mol/L作用物液0.15 0.20 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0 光吸收值0.412 0.459 0.535 0.545 0.444 0.459 0.701 0

18、圖1 Km測定圖由圖1可知,Km值測定曲線y=3.747 x+1.188,計算出Km值等于3.154mmol/L 2.2 最適pH及酸堿穩(wěn)定性實驗2.2.1 pH-活性曲線測定表8 pH活性曲線制作管號 1 2 3 4 5 反應pH 8 9 10 11 12 10A5100.007 0.011 0.038 0.036 0 0圖2 pH-活性曲線由上述數(shù)據(jù)和圖2可知,堿性磷酸酶在本實驗條件下的的最適pH值為102.2.2 酸堿穩(wěn)定范圍的測定表9 酸堿穩(wěn)定范圍曲線的制作管號 1 2 3 4 5 0處理pH 8 9 10 11 12 100.167 0.171 0.131 0.019 0 0A510

19、 圖3酸堿穩(wěn)定范圍曲線由上述數(shù)據(jù)和圖3可知,堿性磷酸酶在本實驗條件下的酸堿穩(wěn)定范圍為pH值8-9,在pH值為9時最為穩(wěn)定。在高PH下酶的活力受到很大的影響,曲線呈下降趨勢。2.3 最適溫度及熱穩(wěn)定性實驗2.3.1 溫度活性曲線表10 溫度活性曲線制作管號 1 2 3 0反應溫度25 37 80 370.171 0.212 0.034 0A510 圖4 溫度-活性曲線由上述數(shù)據(jù)與圖4可知,堿性磷酸酶在本實驗條件下的最適溫度為37,溫度為80高溫時,酶部分失活,曲線下降。2.3.2 熱穩(wěn)定性測定表11 熱穩(wěn)定范圍曲線制作管號 1 2 3 0熱處理溫度25 37 80 250.214 0.203 0

20、 0A510 圖5 熱穩(wěn)定范圍曲線由上述表中數(shù)據(jù)與圖5可知,堿性磷酸酶在本實驗條件下的熱穩(wěn)定范圍為25-37之間,在37時最為穩(wěn)定,酶活最高,在高溫情況下酶不穩(wěn)定,部分失活,曲線快速下降。2.4 抑制劑類型鑒別表12抑制劑類型曲線制作管號 1 2 3 4 5 02 4 6 8 16 0最終底物濃度0.253 0.287 0.403 0.494 0.396 0A510 圖6 抑制劑類型曲線由圖6可知,抑制劑Km值測定曲線y=4.111x+1.985,計算Km值等,2.071mmol/L,與未加抑制劑時的Km值相比較,表明該抑制劑屬于反競爭性抑制。3. 結論與討論3.1 結論通過本實驗,可知堿性磷

21、酸酶在本次的實驗條件下Km值為3.154,最適pH 值為10,在本實驗條件下的酸堿穩(wěn)定范圍為pH值8-9,在pH值為9時最為穩(wěn)定。在高PH下酶的活力受到很大的影響。在本實驗條件下堿性磷酸酶的最適溫度為37,溫度為80高溫時,酶失活,酶活下降直至0,堿性磷酸酶在本實驗條件下的熱穩(wěn)定范圍為25-37之間,在37時最為穩(wěn)定,酶活最高,在低于最適溫度時,酶活很低,隨溫度的升高酶活隨之上升,直到最適溫度達到最大,在高溫情況下酶不穩(wěn)定,部分失活,曲線快速下降。此次實驗采用的抑制劑類型屬于反競爭性抑制。3.2 討論此次試驗過程中,我們嚴格按照實驗室原則與規(guī)范的實驗步驟進行操作,純化后的堿性磷酸酶濃度很高,在后面測定酶學性質過程沒有稀釋到合適的濃度,導致第一次測出來的吸光度較大,不能很好地處理數(shù)據(jù),但是經(jīng)過有效地稀釋跟重復試驗后得到了期望的結果,盡管實驗過程中注意實驗條件的控制,但是仍然有不準確的數(shù)據(jù)出現(xiàn),出現(xiàn)了誤差,導致做