結(jié)核分支桿菌katG蛋白的高表達(dá)與純化

1、    關(guān)鍵詞：分支桿菌結(jié)核；katG；基因表達(dá)；蛋白純化 【摘要】目的表達(dá)與純化結(jié)核分支桿菌katG蛋白，為深入研究異煙肼耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法將含有katG基因的pET24b-katG表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，在異丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)下表達(dá)，分別對(duì)不同誘導(dǎo)時(shí)間的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE以及考馬斯亮藍(lán)染色。獲得穩(wěn)定的高表達(dá)菌株后采用XpressTM蛋白純化系統(tǒng)對(duì)超聲破菌液進(jìn)行純化。最后對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行過(guò)氧化氫酶活性的初步檢測(cè)。結(jié)果對(duì)誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌菌液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)以

2、及考馬斯亮藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約為80000。表達(dá)蛋白量約占總蛋白量的17.7%。對(duì)重組katG基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以350mmol/L咪唑洗脫時(shí)的純化效果最理想，蛋白純度可達(dá)90%以上。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行過(guò)氧化氫酶活性初步檢測(cè)證明，重組的katG基因產(chǎn)物具有過(guò)氧化氫酶活性。HTH結(jié)論通過(guò)pET24b-katG表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌可獲得基因重組的katG高表達(dá)菌株，表達(dá)產(chǎn)物具有一定酶活性，經(jīng)純化后可達(dá)到較高的純度。 Overexpressionandpurificationofcatalase-peroxidasekatGfrommycobacteriumtuberculosis

3、【Abstract】ObjectiveToexpressandpurifythecatalase-peroxidasekatGgenefrommycobacteriumtuberculosis.MethodsPlasmidpET24bcontainingkatGwastransferredintocompetentEscherichiacoliandkatGgenewasoverexpressedbythechallengeofisopropylthio-D-glactoside(IPTG).TheexpressionofkatGproteinwasone-steppurifiedbyXpre

4、sssystemTM.Furthermore,thecatalaseactivityofkatGproteinwaspreliminarilydetected.ResultsTherecombinantescherichiacoliproducedkatGproteininlargequantities,accountingfor17.7%oftotalcellprotein.ThemolecularmassofkatGproteinwasestimatedtobe80000bysodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegradientgelelectrophres

5、is(SDS-PAGE).Itwasfoundthatimidazoleattheconcentrationof350mmol/LcouldelutethekatGproteinmostefficientlyandyieldthefinalpreparationatgreaterthan90%purity.ThekatGproteinwaspreliminarilydetectedtohavetheactivityofcatalase.ConclusionsThestablekatGoverexpressingrecombinantEscherichiacolicanbeconstructed

6、bytheplasmidpET24bcontainingkatGgene.TherecombinantstraincanproducekatGproteinwithcatalaseactivityandtheproductofwhichcanbepurifiedintohigheractivity. 【Keywords】Mycobacteriumtuberculosis;katG;Geneexpression;Proteinpurification 異煙肼(INH)是一種最經(jīng)濟(jì)有效的抗癆藥，幾乎所有的抗癆方案中均包括INH。結(jié)核分支桿菌編碼的katG基因的突變可致結(jié)核分支桿菌對(duì)INH產(chǎn)生耐藥性

7、。自1992年以來(lái)，對(duì)于katG基因變異或缺失造成分支桿菌對(duì)異煙肼耐藥的基因水平研究已較為深入1，2，有必要在蛋白水平對(duì)耐藥機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。本研究將含有katG基因的pET24b-katG表達(dá)載體轉(zhuǎn)化埃希大腸桿菌BL21(DE3)菌株，獲得穩(wěn)定的高表達(dá)菌株后進(jìn)一步對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化，并對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行了酶活性的初步檢測(cè)。 材料與方法 一、材料 (一)質(zhì)粒與菌株表達(dá)質(zhì)粒pET24b-katG與埃希大腸桿菌BL21(DE3)由復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所惠贈(zèng)。 (二)試劑XpressTM蛋白純化系統(tǒng)為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；異丙基-D硫代半乳糖苷(IPTG)為華美生物工程公司產(chǎn)品；其他主要生

8、化試劑為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品或國(guó)內(nèi)AR級(jí)產(chǎn)品。 二、方法 (一)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化與基因產(chǎn)物的表達(dá)將表達(dá)質(zhì)粒pET24b-katG轉(zhuǎn)化用氯化鈣處理法得到的感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)菌株，將菌株涂于含卡那霉素的LB平板上，30°C過(guò)夜培養(yǎng)。挑取抗卡那霉素的菌株接種于20ml的LB培養(yǎng)基(加入20%的葡萄糖0.2ml，濃度50mg/ml的卡那霉素40l,濃度20mg/ml的氯霉素34l)中，37°C，160r/min振搖過(guò)夜。取3ml過(guò)夜培養(yǎng)物種入100ml的LB培養(yǎng)基(含20%的葡萄糖1ml，濃度10mg/ml的卡那霉素400l，濃度20mg/ml的氯霉素170l)中，3

9、7°C以160r/min振搖，每20min測(cè)定1次A600值，直至A600值到達(dá)0.40.5(勿超過(guò)0.5)。隨后每100mlLB培養(yǎng)基中加入1mol/LIPTG400l，分別在加入IPTG后的第2、3、4、5、6h收集菌液。將菌液在4°C下，5000g，離心5min，棄上清。將沉淀物以10ml緩沖液(50mmol/LTris.Cl,pH8.0,2mmol/LEDTA,0.1%TritonX-100)重新懸浮，加入溶菌酶(100g/ml)。在冰浴中以中等強(qiáng)度超聲破菌，每次10s，共3次，破菌后，4°C，離心5min，收集上清液備用。 (二)表達(dá)產(chǎn)物的十二烷基硫酸鈉

10、-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)參照文獻(xiàn)進(jìn)行。收集IPTG誘導(dǎo)后的菌液10l，與加樣液10l混合，100°C水浴，3min后點(diǎn)樣，25mA恒流通電進(jìn)行SDS-PAGE。電泳后以考馬斯亮藍(lán)染色15min，然后以脫色液脫色觀察結(jié)果。 (三)表達(dá)產(chǎn)物的純化采用XpressTM蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。用無(wú)菌雙蒸水懸浮樹(shù)脂純化柱3次。加入7ml結(jié)合液(20mmol/L磷酸鈉，500mmol/L氯化鈉，pH7.8)，以及經(jīng)IPTG不同時(shí)間誘導(dǎo)后產(chǎn)量最高的破菌液上清5ml，重新懸浮純化柱。反復(fù)輕搖混合2min。靜置10min，吸棄上清，再加入破菌液上清5ml重復(fù)以上步驟。以4ml結(jié)合液重

11、新懸浮純化柱，溫和搖動(dòng)混合2min，靜置沉淀，吸棄上清，共3次。再以沖洗緩沖液(20mmol/L磷酸鈉，500mmol/L氯化鈉，pH6.0)洗4次，分別以不同濃度的咪唑洗脫液(50、200、350、500mmol/L)各5ml加入柱中，收集不同洗脫濃度的洗脫液。將洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE。將純化后的蛋白以85%的硫酸胺沉淀，離心后將沉淀物以無(wú)菌雙蒸水溶解，4°C透析過(guò)夜。透析產(chǎn)物加入甘油(40%)后貯藏于-80°C的環(huán)境下。 (四)過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定對(duì)破菌液上清進(jìn)行過(guò)氧化氫酶活性的初步測(cè)定。用磷酸鹽(K2HPO4+KH2PO4,0.1mol/L)與NaCl(2mol/L

12、)的緩沖液配制10%的Tween80溶液，取5ml與30%的雙氧水5ml混合。分對(duì)照管與katG管，在katG管內(nèi)加入不同容積的含pET-katG表達(dá)質(zhì)粒的菌株破菌上清(20、40、80、160l)，對(duì)照管則加入含pET空載體的菌株破菌上清，10min后觀察氣泡產(chǎn)生情況。如產(chǎn)生大量氣泡則提示酶活性較佳。 結(jié)果 一、重組katG蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)以及產(chǎn)物的鑒定分析 將含有katG基因的pET24b-katG表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)，分別對(duì)不同誘導(dǎo)時(shí)間的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE以及考馬斯亮藍(lán)染色，可在相對(duì)分子質(zhì)量80000處見(jiàn)一誘導(dǎo)表達(dá)帶(圖1)。比較不同誘導(dǎo)時(shí)間的表達(dá)產(chǎn)量可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)2h后的表達(dá)產(chǎn)量已達(dá)到峰值。在其后蛋白純化中即可選取該誘導(dǎo)時(shí)間的產(chǎn)物。對(duì)此誘導(dǎo)表達(dá)帶進(jìn)行黑度密度自動(dòng)掃描分析，此處表達(dá)蛋白量約占總菌體蛋白量的17.7%。 二、重組katG基因表達(dá)產(chǎn)物的純化結(jié)果 采用XpressTM蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化發(fā)現(xiàn)，分別以不同濃度的咪唑洗脫液(50、200、350、500mmol/L)洗脫純化柱后，所收集的洗脫液再次進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以350mmol/L咪唑洗脫后純化的效率最高，通過(guò)SDS-PAGE黑度密度自動(dòng)掃描分析可以發(fā)現(xiàn)純