牛初乳中乳鐵蛋白的分離純化與免疫功能檢測

1、牛初乳中乳鐵蛋白的分離純化與免疫功能檢測葉震敏1，王志耕2, *，余為一2(1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 蘇州 215007；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230061摘要：牛初乳經(jīng)離心、鹽析后獲得乳鐵蛋白粗提物，通過CM-Sephadex C50離子交換色譜和Heparin-Sepharose CL-6B 親和色譜純化獲得純度分別為76.98%和92.75%的乳鐵蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 檢測乳鐵蛋白存在分子質(zhì)量分別為76000Da 和78000Da 的兩種異構(gòu)體，免疫電泳說明提純樣品與乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的免疫原性。小白鼠喂養(yǎng)和免疫實驗說明乳鐵蛋白可提高機體免疫功能。關(guān)鍵詞：初

2、乳；乳鐵蛋白；分離提純；免疫功能Isolation and Purification of Lactoferrin in Bovine Colostrums and Delection of Its Immune FunctionYE Zhen-min1，WANG Zhi-geng2, *，YU Wei-yi2(1.College of Medicine, SooChow University, Suzhou 215007,China;2.College of Animal Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230061,ChinaAb

3、stract ：The lactoferrin was purified by centrifugation and ammonium sulfate precipitation from the bovine colostrums. Thepurity of lactoferrin after CM-Sephadex C50 ion-exchange chromatograph and Heparin-Sepharose CL-6B affinity chromato-graph was 76.98%and 92.75% respectively. The two kinds of lact

4、oferrin isomers were assayed by SDS-PAGE and HPLC withthe molecular weights 76000Da and 78000Da respectively. The purified sample and standard lactoferrin showed the sameimmunogens through immunoelectrophoresis. The isolated lactoferrin improved the immune function significantly in miceexperiments.K

5、ey words：colostrums ；lactoferrin ；isolation and purification；immune function中圖分類號： S852.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1002-6630(200507-0208-04乳鐵蛋白(Lf，lactoferrin 是一種主要存在于大多數(shù)哺乳動物乳汁中的鐵結(jié)合性糖蛋白，它在增強機體免疫能力，調(diào)節(jié)機體生理狀態(tài)平衡，改善胃腸功能，抗菌、抗病毒等方面起著重要作用1。乳鐵蛋白已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料、生化以及化妝品領(lǐng)域。作為純天然功能因子，其開發(fā)利用已引起人們的高度關(guān)注2。本文建立了實驗室分離提純具有生物學(xué)活性的較高純

6、度乳鐵蛋白的技術(shù)路線和方法，并對其提高機體體液免疫的活性進(jìn)行了驗證性研究，以期為高純度乳鐵蛋白工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。1.1材料與方法材料初乳取自合肥奶牛場；CM-Sephadex C50樹脂、Hepari n-Sepharose CL-6B 樹脂購自Pharm acia 公司；AKTA-FPLC unicom3.21、monosHR5/5高效液相色譜系統(tǒng)購自Pharmacia 公司；中分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白來自上海生化所；乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma 公司；弗氏佐劑自行制備；實驗動物來源于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。方法粗提取中國荷斯坦奶牛產(chǎn)犢后24h 內(nèi)的牛初乳，4下4000g 離心

7、30m in 脫乳脂，調(diào)pH 。至4.6，25下4000g 離心30min 去除酪蛋白后，用42%飽和(NH4 2SO 4鹽析后2000g 離心20min 。取乳清即為乳鐵蛋白粗提物。收稿日期：2004-10-27 *通訊作者基金項目：安徽省“十五”農(nóng)產(chǎn)品加工重大專項(01703004(19-1.2.2離子交換色譜將透析的乳清樣品加入平衡過的2×33cm CM-Sephadex C50離子交換柱。 分別用pH8.0含0、0.3、0. 5、0.7mol/LNaCl的0.05mol/L磷酸鉀緩沖液(PBS以60ml/h 流速分段洗脫。 根據(jù)峰值曲線收集含乳鐵蛋白的洗脫液。親和色譜取透析的

8、乳清樣品加入平衡過的1.6×9.5cm Hep-arin-Sepharose CL-6B 的親和層析柱，用pH7.4含01mol/L NaCl 的5mmol/L巴比妥鈉-鹽酸緩沖液以90ml/h進(jìn)行線性洗脫。根據(jù)峰值曲線收集含乳鐵蛋白的洗脫液。兔抗乳鐵蛋白高免血清的制備將乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品與完全弗氏佐劑充分混勻后皮下多點接種日本大耳白，一周后用不完全弗氏佐劑皮內(nèi)接種，兩周后再用不完全弗氏佐劑腹腔接種，免疫接種四次后獲得兔抗乳鐵蛋白抗血清。1.2.5純度與免疫學(xué)鑒定提純的乳鐵蛋白樣品經(jīng)過12% SDS-PAGE電泳鑒定其分子量與純度。分別將離子交換色譜和親和色譜純化獲得的乳鐵蛋白樣品凍干后

9、用HPLC 檢測純度。并將提純樣品與兔抗乳鐵蛋白抗血清進(jìn)行免疫電泳。免疫活性檢測將昆明種小白鼠分成兩組，每組12只，對照組正常飼喂，實驗組在對照組基礎(chǔ)上每天每籠在飲水中按0.1mg/g體重添加乳鐵蛋白。同時在第1、14、21d 對每只小白鼠按0.5ml/只劑量腹腔注射2%雞紅細(xì)胞懸液。并在第1、14、21、28d 每組中取三只小白鼠進(jìn)行心臟采血，制備鼠抗雞紅細(xì)胞抗血清。對抗血清做倍比稀釋與2%雞紅細(xì)胞懸液進(jìn)行血凝反應(yīng)，測定血凝價。2.1結(jié)果與分析離子交換色譜純化乳鐵蛋白.乳鐵蛋白分子量和純度的測定提純樣品經(jīng)3%濃縮膠，12%分離膠的SDS-PAGE 電泳檢測，

10、 Heparin-Sepharose CL-6B親和色譜純化的樣品分子量為76000 Da，CM-Sephadex C50離子交換色譜純化的樣品存在兩種異構(gòu)體，分子量分別為76000Da 和78000Da, 與標(biāo)準(zhǔn)乳鐵蛋白分子量一致，如圖3。經(jīng)HPLC 檢測CM-Sephadex C50離子交換色譜純化的樣品純度為76.98%(如圖4 。 Heparin-Sepharose CL-6B親和色譜純化的樣品純度為92.75%(如圖5 。由圖1可見經(jīng)CM-Sephadex C50離子交換色譜純化，大部分雜蛋白被低離子強度的PB S 緩沖液洗脫下來，而第2個和第3個蛋白峰則分別在離子強度為0.5mol

11、/L NaCl和0.7mol/L NaCl 時被洗脫下來。經(jīng)12% SDS-PAGE 電泳顯示第3個蛋白峰為乳鐵蛋白，并且存在兩條帶，分子量分別為76000Da 和78000Da ，與報道的一致(如圖3 。2.2親和色譜純化乳鐵蛋白由圖2可見 經(jīng)Heparin-Sepharose CL-6B親和層析色圖鑒定乳鐵蛋白的純度與分子量Fig.3 Identification of purity and molecular weight of lactoferrinthrough SDS-PAGE譜純化，大部分雜蛋白與肝素?zé)o法結(jié)合或結(jié)合力弱，在01mol/L NaCl線性洗脫過程中很快被洗脫下來(第1

12、、2峰 ，在約0.7mol/LNaCl離子強度下洗脫的蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳檢測分子量為76000Da(第3峰 ，與報道一致。圖乳鐵蛋白對小白鼠抗雞紅細(xì)胞凝集價影響圖Fig.7 The influencing chart of lactoferrin to mice anti chookerythrocyte agglutinative level路線。根據(jù)乳鐵蛋白的理化特性，篩選出CM-Sephadex C50離子交換色譜和Heparin-Sepharose CL-6B親和色譜純化乳鐵蛋白的技術(shù)參數(shù)，建立了實驗室分離純化乳鐵蛋白的方法，為乳鐵蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。CM-Sep

13、hadex C50離子交換色譜和Heparin-Sepharose CL-6B 親和色譜均可用于純化乳鐵蛋白，CM-Sephadex C50離子交換色譜純化的樣品純度為76.98%， Hepari n-Sepharose CL-6B 親和色譜純化的樣品純度為92.75%.，親和色譜純化成本約為離子交換色譜的5倍左右，可根據(jù)產(chǎn)品純度要求選擇分離純化方法， 乳鐵蛋白出現(xiàn)兩個不同分子量的異構(gòu)體是由結(jié)合糖基的多少以及鐵離子結(jié)合狀態(tài)引起的。因此不同異構(gòu)體乳鐵蛋白在不同pH 條件下，荷電量不同，易在離子交換層析中被分離開來8。乳鐵蛋白作為一種鐵結(jié)合性的糖蛋白，鐵的結(jié)合程度影響乳鐵蛋白的分子質(zhì)量9，另外碳水

14、化合物含量約占總分子質(zhì)量的7%。牛初乳中乳鐵蛋白的核苷酸序列上有5個潛在的糖基化位點，不同數(shù)目的糖基結(jié)合也可以造成乳鐵蛋白的分子量不同。通過小白鼠喂養(yǎng)與免疫實驗發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白具有顯著提高機體抗外源性抗原的功能。凝集價的差異說明乳鐵蛋白具有促進(jìn)B 細(xì)胞成熟、刺激B 細(xì)胞分泌免疫球蛋白的功能。這是因為在粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面存在乳鐵蛋白受體10,11。乳鐵蛋白可作為蛋白信號分子參與免疫細(xì)胞的發(fā)育過程，促進(jìn)免疫細(xì)胞的成熟。另外，乳鐵蛋白可與D N A 分子結(jié)合，以反式作圖免疫電泳檢測純化樣品Fig.6 Detection of sample with immunoelectrophore

15、sis免疫電泳鑒定提純樣品將提純樣品和乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別與自行制備的兔抗乳鐵蛋白抗血清進(jìn)行免疫電泳反應(yīng)，結(jié)果如圖6。提純樣品和標(biāo)準(zhǔn)品在相同位置與乳鐵蛋白抗體產(chǎn)生免疫沉淀帶。說明提純樣品在免疫原性上與標(biāo)準(zhǔn)乳鐵蛋白是一致的。2.4用元件的形式啟動細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)活化細(xì)胞分泌免疫球蛋白或細(xì)胞因子，達(dá)到提高機體免疫力的作用1214。參考文獻(xiàn)：123曹勁松. 初乳功能性食品M. 北京. 中國輕工業(yè)出版社, 2000.顧瑞霞. 乳與乳制品的生理功能特性M. 北京. 中國輕工業(yè)出版社, 2000.金世琳. 生物技術(shù)應(yīng)用于乳業(yè)的最新發(fā)展J. 中國乳品工2.5乳鐵蛋白免疫功能鑒定小白鼠的喂養(yǎng)和免疫實驗結(jié)果如圖7

16、顯示，實驗組的小白鼠飲水中添加乳鐵蛋白，其凝集價明顯高于不添加乳鐵蛋白的對照組。討論本研究探索了從牛初乳中分離純化乳鐵蛋白的技術(shù)海參多糖對小白鼠傷口愈合的影響遲玉森，莊桂東，黃福祥，安桂香，徐 鵬(萊陽農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系，山東 萊陽 265200摘要：目的：觀察研究海洋生物多糖對傷口愈合的促進(jìn)作用 通過給小白鼠人為制造傷口并配合灌胃海洋生物多糖來建立一種能夠很好地觀察傷口愈合情況的方法，并且通過實驗。方法：于小鼠背部皮膚定位，然后制造一圓形傷口，實驗組用海洋多糖每天灌胃0.5ml ，對照組用自來水每天灌胃0.5ml 。結(jié)論：海洋生物多糖能夠促進(jìn)傷口的愈合。關(guān)鍵詞：傷口愈合；海洋多糖；毛細(xì)血管He

17、aling Effects on White Rats Wound by Marine PolysaccharideCHI Yu-sen，ZHANG Gui-dong，HUANG Fu-xiang，AN Gui-xiang，XU Peng(Department of Food Science, Laiyang Agricultural College ,Laiyang 265200,ChinaAbstract ：Objective: To observe the effects of marine polysaccharide on healing of the white rats woun

18、d. Methods: Orientedon the rats back skin ，a round wound is made. Then a dose of 0.5ml polysaccharide is gavage instilled into the rats stomachevery day to compare with the control team of rats which are gavage instilled with the same dose of water. Results: shows thatmarine polysaccharide can accel

19、erate the healing of the wound.Key words：the healing of the wound；marine polysaccharide；blood capillary收稿日期：2004-10-18作者簡介：遲玉森(1962- ，男，教授，博士后，研究方向為生物活性物質(zhì)提取及應(yīng)用。4業(yè), 1998, 26(1: 18-20.Martin C Harmsen, et al. Antiviral effects of plasma andmilk proteins: Lactoferrin shows potent activity against bothh

20、uman immunodeficiency virus and human cytomegalovirusreplication in vitroJ. The Journal of Infectious Diseases,1995, 172:380-388 .Li Lu, Rong-Nian Shen,Shang Zhen Zhou. Synergistic effectof human lactoferrin and recombinant murine interferon ondisease progression in mice interfected with the poly-cy

21、themia-inducing strain Ff the Friend Virus complexJ.International Journal of Hemotology, 1991,(54:117-124.Will Brink, et al. The bioactive peptide that fights disease:lactoferrinJ. LE Magazine, 2000.郭本恒, 程玉倩, 駱承庠. 乳鐵蛋白J. 中國乳品工業(yè),1995, 23(3:117-120.Soichi tsuji, et al. Two apparent molecular forms of bovinelactoferrinJ. J Dairy Sci, 1989,72:1130-1136.Lius Mata, et al. Thermal denaturation of human lactoferrinand its effect on the ability to bind ironJ. J Agric Food Chem,1998,65:401-411.10Chun W Wong, et al. Comparison of immunomodulatoryproperties of purified lac