第十一章固相膜免疫分析技術(shù)

1、檢驗(yàn)學(xué)院 何 濤【目的要求】1、掌握：免疫金標(biāo)記技術(shù)、膠體金、免疫金的概念，金免疫測(cè)定技術(shù)的類(lèi)型、原理和臨床應(yīng)用；2、了解：斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)、免疫印跡試驗(yàn)。概述 固相膜免疫分析技術(shù) 以微孔膜作為固相載體，利用液體可以流過(guò)微孔膜也可以通過(guò)毛細(xì)血管作用在膜上向前移行的特性，以酶標(biāo)記或各種有色微粒子標(biāo)記抗體或抗原作為標(biāo)記物，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行抗原或抗體檢測(cè)的快速檢驗(yàn)方法。固相膜免疫固相膜免疫分析技術(shù)分析技術(shù)其他膜載體免疫其他膜載體免疫分析技術(shù)分析技術(shù)膠體金免疫膠體金免疫技術(shù)技術(shù)斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)免疫印跡試驗(yàn)免疫印跡試驗(yàn)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)斑點(diǎn)金

2、免疫層析試驗(yàn)第一節(jié)第一節(jié) 膠體金免疫技術(shù)膠體金免疫技術(shù) 膠體金免疫技術(shù)：是一種以膠體金作膠體金免疫技術(shù)：是一種以膠體金作為標(biāo)記物的免疫標(biāo)記技術(shù)。為標(biāo)記物的免疫標(biāo)記技術(shù)。一、 膠體金與免疫金的制備（一）、膠體金的特性（一）、膠體金的特性1、膠體特征、膠體特征 膠體金也稱(chēng)金溶膠，是由膠體金也稱(chēng)金溶膠，是由 金鹽被還原成原子金金鹽被還原成原子金(Au) 后形成的金顆粒懸液。后形成的金顆粒懸液。 膠體金顆粒大小多在膠體金顆粒大小多在1100nm，微小金顆，微小金顆粒穩(wěn)定、均勻、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液粒穩(wěn)定、均勻、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中，成為膠體金溶液。體中，成為膠體金溶液。 2、呈色性和光吸收性、

3、呈色性和光吸收性 3、穩(wěn)定性、穩(wěn)定性對(duì)電解質(zhì)較敏感，電解質(zhì)可破壞膠體金外周水對(duì)電解質(zhì)較敏感，電解質(zhì)可破壞膠體金外周水化層，而使其聚體沉淀下來(lái)?；瘜?，而使其聚體沉淀下來(lái)。（二）膠體金的制備（二）膠體金的制備 向一定濃度的金溶液中加入一定量的還向一定濃度的金溶液中加入一定量的還原劑使金離子還原成為金原子，形成金顆粒原劑使金離子還原成為金原子，形成金顆粒懸液。常用的還原劑有：懸液。常用的還原劑有：枸櫞酸鈉枸櫞酸鈉、白磷、白磷、乙醇、過(guò)氧化氫、硼氫化鈉、抗壞血酸、鞣乙醇、過(guò)氧化氫、硼氫化鈉、抗壞血酸、鞣酸等。酸等。以枸櫞酸鈉為例說(shuō)明制備方法：1、制備一定濃度的HAuCl4水溶液，加熱至沸。2、攪動(dòng)下準(zhǔn)

4、確加入一定量的枸櫞酸三鈉水溶液。3、繼續(xù)加熱煮沸一定時(shí)間。觀察溶液變化：淡黃色 灰色 黑色 紅色。4、冷卻至室溫后加蒸餾水恢復(fù)至原體積。膠體金的鑒定膠體金的鑒定 主要鑒定指標(biāo)有：顆粒大小、粒徑的均一主要鑒定指標(biāo)有：顆粒大小、粒徑的均一呈度、有無(wú)凝集顆粒。呈度、有無(wú)凝集顆粒。 良好的膠體金應(yīng)該是良好的膠體金應(yīng)該是清亮透明的清亮透明的，如混濁，如混濁或液體表面有漂浮物，提示制備的膠體金有或液體表面有漂浮物，提示制備的膠體金有較多的凝集顆粒。較多的凝集顆粒。膠體金的保存：膠體金的保存：膠體金在潔凈的玻璃器皿中可較長(zhǎng)時(shí)膠體金在潔凈的玻璃器皿中可較長(zhǎng)時(shí)間保存。間保存。制備膠體金的注意事項(xiàng)：制備膠體金的注

5、意事項(xiàng)：(1)氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。(2)氯金酸對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，因此，氯金酸對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，因此，在配制及保存時(shí)不能用金屬器皿。在配制及保存時(shí)不能用金屬器皿。(3)制備膠體金的水應(yīng)是雙蒸餾水或三雙蒸制備膠體金的水應(yīng)是雙蒸餾水或三雙蒸餾水。餾水。(4)用于制備膠體金的玻璃容器必須是約對(duì)用于制備膠體金的玻璃容器必須是約對(duì)清潔的。清潔的。（三）免疫金的制備（三）免疫金的制備 膠體金與抗原膠體金與抗原(抗體抗體)的結(jié)合物稱(chēng)為免的結(jié)合物稱(chēng)為免疫金或膠體金標(biāo)記物。疫金或膠體金標(biāo)記物。免疫金的制備方法：免疫金的制備方法：1、膠體金溶液的、膠體金溶液的PH

6、調(diào)整：調(diào)整：PH值的確定原則上是值的確定原則上是選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。2、蛋白質(zhì)最適標(biāo)記量的確定：用稀釋法確定。蛋、蛋白質(zhì)最適標(biāo)記量的確定：用稀釋法確定。蛋白質(zhì)不足的管顏色由紅變藍(lán)；蛋白質(zhì)足的管保持紅白質(zhì)不足的管顏色由紅變藍(lán)；蛋白質(zhì)足的管保持紅色來(lái)變。色來(lái)變。3、標(biāo)記過(guò)程：在電磁攪拌下將、標(biāo)記過(guò)程：在電磁攪拌下將1/10體積的合適濃體積的合適濃度的蛋白溶液加入膠體金溶液中，反應(yīng)一定時(shí)間后度的蛋白溶液加入膠體金溶液中，反應(yīng)一定時(shí)間后加入加入BSA并調(diào)整至并調(diào)整至PH8.5，放置室溫?cái)?shù)分鐘。，放置室溫?cái)?shù)分鐘。4、離心去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)。、離心去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)。（一）斑點(diǎn)

7、金免疫滲濾試驗(yàn)（一）斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)(DIGFA)原理原理：是以硝酸纖維素膜為載是以硝酸纖維素膜為載 體并包被了抗體并包被了抗原或抗體的滲濾裝置中，依次滴加標(biāo)本、免原或抗體的滲濾裝置中，依次滴加標(biāo)本、免疫金及洗滌液，因微孔濾膜帖置于吸水材料疫金及洗滌液，因微孔濾膜帖置于吸水材料上故溶液流經(jīng)滲濾裝置時(shí)與膜上的抗原或抗上故溶液流經(jīng)滲濾裝置時(shí)與膜上的抗原或抗體快速結(jié)合并起到濃縮作用，達(dá)到快速檢測(cè)體快速結(jié)合并起到濃縮作用，達(dá)到快速檢測(cè)目的。陽(yáng)性反應(yīng)在膜上呈現(xiàn)目的。陽(yáng)性反應(yīng)在膜上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)紅色斑點(diǎn)。二、膠體金免疫技術(shù)的方法種類(lèi)和原理（二）斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（二）斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)(DIGA)原理：原

8、理：是將膠體金標(biāo)記技術(shù)和蛋白質(zhì)層析技術(shù)相結(jié)合的是將膠體金標(biāo)記技術(shù)和蛋白質(zhì)層析技術(shù)相結(jié)合的以硝酸纖維素膜為載體的固相膜免疫技術(shù)，與斑點(diǎn)金免以硝酸纖維素膜為載體的固相膜免疫技術(shù)，與斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)的過(guò)濾性能不同，疫滲濾試驗(yàn)的過(guò)濾性能不同，DIGA中滴加在膜一端的中滴加在膜一端的標(biāo)本溶液受載體膜的毛細(xì)管作用向另一端移動(dòng)，猶如層標(biāo)本溶液受載體膜的毛細(xì)管作用向另一端移動(dòng)，猶如層析一般，在移動(dòng)過(guò)程中被分析物與固定于載體上某一區(qū)析一般，在移動(dòng)過(guò)程中被分析物與固定于載體上某一區(qū)域的抗體或抗原結(jié)合而被固相化，無(wú)關(guān)物則越過(guò)該區(qū)域域的抗體或抗原結(jié)合而被固相化，無(wú)關(guān)物則越過(guò)該區(qū)域而被分離，然后通過(guò)膠體金的呈色條帶來(lái)判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而被分離，然后通過(guò)膠體金的呈色條帶來(lái)判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A.B都為吸水材料， R為金標(biāo)抗體干片，T區(qū)包被特異性抗體， C區(qū)包被羊抗兔免疫球蛋白抗體（1）雙抗體夾心法 A（2）間接法（3）結(jié)果判斷（三）臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：本法操作簡(jiǎn)單、快捷以及操作人員不需技術(shù)培訓(xùn)，無(wú)需儀器設(shè)備試劑穩(wěn)定，便于保存，已成為“床旁