B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

1、1、B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)對(duì)于多種免疫學(xué)研究是必不可少的。 針對(duì)不同的蛋白， 應(yīng)選擇不同的方法。 一般來說，蛋白質(zhì)的C端具有較好的親水性、表面可及性和柔性，所以是很好的抗原決定簇區(qū)域。本課題選用的蛋白質(zhì)C-末端序列標(biāo)簽都是唯一的、或是其家族中的幾個(gè)成員所共有的。在人蛋白質(zhì)中，約81%的蛋白質(zhì)其C末端的5個(gè)氨基酸殘基的小肽是該蛋白質(zhì)所特有的，制備針對(duì)蛋白質(zhì)C末端小肽的抗體，常常能得到特異性識(shí)別該全蛋白的抗體。另外，蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)是B細(xì)胞表位計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的重要參數(shù)之一，3轉(zhuǎn)角為凸出結(jié)構(gòu)，多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表面，有利于與抗體結(jié)合，較可能成為抗原表位。而a螺旋和3折疊結(jié)構(gòu)規(guī)則不易變形，較難結(jié)合抗體，一般不作為抗

2、原表位。含有5個(gè)以上的氨基酸殘基的轉(zhuǎn)角又常稱為環(huán)(loop)。以往的研究表明，蛋白表面的loop區(qū)可能為功能性抗體的識(shí)別位點(diǎn)，特異性好，可及性強(qiáng)。本課題選用的HPO、G-CSF、HSA空間結(jié)構(gòu)已明確，所以直接選擇loop區(qū)或無規(guī)卷曲作為B細(xì)胞表位。-舉例：人Pif1基因編碼至少兩種蛋白亞型，分子量分別為74kDa和80kDa,與酵母具有高度的同源性，口型和3型Pif1只有C末端不同20,其余部分完全相同，并且二者的C末端在蛋白數(shù)據(jù)庫中都是唯一的，選擇a型和3型的C末端作為B細(xì)胞表位，既滿足特異性的需要，也能區(qū)分亞型。GPAA1是一種跨膜蛋白，原核表達(dá)非常困難，形成包涵體，且包涵體難以溶解和復(fù)性

3、。對(duì)這一類型的蛋白，非常適合選擇其特有的B細(xì)胞表位免疫動(dòng)物，來最終制備識(shí)別全蛋白質(zhì)的抗體。ABCpred是基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的線性B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)工具，該系統(tǒng)檢驗(yàn)了源于Bcipep數(shù)據(jù)庫的700個(gè)非冗余B細(xì)胞表位和源于Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫的700個(gè)長(zhǎng)度為1020個(gè)氨基酸的隨機(jī)選擇多肽，準(zhǔn)確率近66%。Bepipred結(jié)合隱馬爾科夫模型和親水性參數(shù)評(píng)分預(yù)測(cè)線性B細(xì)胞表位，AROC評(píng)分達(dá)到0.671。將兩種預(yù)測(cè)方法得到的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，其共有的預(yù)測(cè)表位是真正B細(xì)胞表位的幾率更大，如果能進(jìn)一步結(jié)合蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，就可以選出可信度更高的B細(xì)胞表位。如何選擇有效的B細(xì)胞表位是能否實(shí)現(xiàn)無完

4、整蛋白質(zhì)抗原條件下抗體制備的關(guān)鍵。2、對(duì)于B細(xì)胞表位的選擇，對(duì)于已有空間結(jié)構(gòu)信息的蛋白質(zhì)抗原，直接選擇蛋白分子表面的loop區(qū)或無規(guī)卷曲區(qū)域的小肽序列作為候選B細(xì)胞表位；對(duì)于缺乏空間結(jié)構(gòu)信息的蛋白質(zhì)抗原，需要根據(jù)蛋白質(zhì)抗原的特點(diǎn)具體分析。若蛋白質(zhì)抗原C末端的序列親水性好，可以選擇C末端的610個(gè)氨基酸的序列作為候選B細(xì)胞表位，并且最好該序列為該蛋白質(zhì)所特有；也可采用B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)程序進(jìn)行分析，選擇不同程序預(yù)測(cè)的共有B細(xì)胞表位；對(duì)于同源性很高的家族蛋白，根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果選擇差異較大的區(qū)域，并且所選序列應(yīng)該符合B細(xì)胞表位的特征?；谝陨显瓌t，本實(shí)驗(yàn)選擇了10個(gè)蛋白的14個(gè)表位，并對(duì)其中的12個(gè)表位

5、進(jìn)行了驗(yàn)證。3、對(duì)于B細(xì)胞表位的選擇，(1)對(duì)于空間結(jié)構(gòu)已知的蛋白質(zhì)，直接選擇蛋白分子表面的loop區(qū)或無規(guī)卷曲區(qū)域的小肽序列。(2)對(duì)于空間結(jié)構(gòu)未知的蛋白質(zhì)，可采用以下策略進(jìn)行選擇：A:若蛋白質(zhì)C末端序列的親水性好，可以選擇C末端的610氨基酸的序列作為候選B細(xì)胞表位，最好該序列為該蛋白質(zhì)所特有。可采用SIBBLASTNetworkService(http:/www.expasy.ch/tools/blast/)的BLAST軟件進(jìn)行比對(duì)，數(shù)據(jù)庫選擇homosapiens;B：采用B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)程序ABCpred和BepiPred等進(jìn)行表位預(yù)測(cè)，選擇不同程序預(yù)測(cè)的共有B細(xì)胞表位；C:對(duì)于同源性

6、很高的蛋白質(zhì)，首先根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果選擇差異較大的區(qū)段，并且所選序列應(yīng)該符合B細(xì)胞表位的特征。4、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分別應(yīng)用EX-PASY服務(wù)器(/tools)上的GOR44、HNN(HierarchicalNeuralNetworkmeth-od)、SOPMA、nnPredictUniversityofCaliforniaatSanFrancisco(UCSF)等方法。親水性、柔韌性、表面可能性和抗原表位預(yù)測(cè)應(yīng)用DNAstar軟件的子程序Protean,采用Hopp-Woods和Kyte-Doolittle方案預(yù)測(cè)氨基酸的親水性5,6,采用Karplus-Sc

7、hultz和Emini方案預(yù)測(cè)柔韌性及表面可能性7,8,采用Jameson-Wolf方案9和吳氏抗原指數(shù)法10預(yù)測(cè)潛在的B細(xì)胞抗原表位。5、對(duì)獲取序列的生物信息學(xué)處理分析使用DNASTAR軟件分析獲取的序列，結(jié)合NCBI上的BLAST尋找最匹配的短序列。用全部和部分肽序列查詢各國專利數(shù)據(jù)庫：/netahtml/PTO/search-adv.ht/http:/ 但是最近Blythe及Flower(BlytheMJetal.,2005)對(duì)氨基酸的性質(zhì)與線性表位的關(guān)系做了一個(gè)評(píng)估，結(jié)果表明基于氨基酸序列信息來預(yù)測(cè)線性表位，即使很好的結(jié)合了氨基酸的各種性質(zhì)，

8、其預(yù)測(cè)結(jié)果僅略強(qiáng)于隨機(jī)預(yù)測(cè)。近年來，一些應(yīng)用隱形馬爾可夫模型(HMM)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)、支持向量機(jī)算法(SVM)及其他技術(shù)的機(jī)器研究方法(PonomarenkoJVetal.,2007)已經(jīng)被引入來預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位，取得了較好的結(jié)果。代表軟件有ABCpred(SahaSetal.,2006)、BepiPred(LarsenJEetal.,2006)、APP(ChenJetal.,2007)等。ABCpred采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來預(yù)測(cè)線性表位，從Bcipep和SwissProt數(shù)據(jù)庫中提取非冗余的表位肽和非表位肽作為訓(xùn)練集，采用5-折交叉驗(yàn)證，預(yù)測(cè)敏感性約為67%,特異性約為64%。BepiP

9、red結(jié)合氨基酸的性質(zhì)(親水性、柔韌性、可及性、極性、暴露表面、轉(zhuǎn)角)和隱形馬爾可夫模型來預(yù)測(cè)線性表位，預(yù)測(cè)結(jié)果表明，同那些僅依賴于氨基酸性質(zhì)的預(yù)測(cè)方法相比，BepiPred預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性有一定程度的提高。Chenetal.(2007)發(fā)現(xiàn)氨基酸通常成對(duì)出現(xiàn)在抗原表位的頻率要比其出現(xiàn)在非表位肽段的頻率高，基于此，并聯(lián)合支持向量機(jī)算法建立了APP方法。應(yīng)用此方法在872個(gè)表位肽和872個(gè)非表位肽數(shù)據(jù)集中，采用5-折交叉驗(yàn)證，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度為71%。YasserEL-Manzalawy(EL-ManzalawyYetal.,2008)等采用同一數(shù)據(jù)集對(duì)這三種方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明ABCpred預(yù)測(cè)表

10、位的準(zhǔn)確性略高于BepiPred及APP。構(gòu)象表位的預(yù)測(cè)方法目前，絕大多數(shù)B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)方法都是基于蛋白質(zhì)的一級(jí)或二級(jí)結(jié)構(gòu)的，但這些方法只能用來預(yù)測(cè)由連續(xù)的氨基酸殘基構(gòu)成的線性表位，而基于蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)來預(yù)測(cè)構(gòu)象表位的方法比較少，這是因?yàn)楦鞣N抗原的構(gòu)象表位可獲得的數(shù)據(jù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于線性表位，并且到目前為止，幾乎沒有哪個(gè)抗原的所有的表位都能夠徹底的研究清楚(HasteAndersenPetal.,2006)。 基 于 蛋 白 質(zhì) 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 來 預(yù) 測(cè) 構(gòu) 象 表 位 的 方 法CEP(Kulkarni-KaleUetal.,2005)(ConformationalEpitopePredict

11、ion):這是第一個(gè)以抗原蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)PDB文件作為輸入條件，以構(gòu)象性表位預(yù)測(cè)為主要目的的網(wǎng)上免費(fèi)服務(wù)軟件。它提供了一個(gè)預(yù)測(cè)構(gòu)象表位的web界面，這種方法除了能夠預(yù)測(cè)構(gòu)象表位，同時(shí)也能預(yù)測(cè)線性表位。它主要根據(jù)氨基酸殘基的溶劑可及性及空間距離截值來預(yù)測(cè)表位，其公布的預(yù)測(cè)精度達(dá)75%。DiscoTope(HasteAndersenPetal.,2006):是通過蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來預(yù)測(cè)構(gòu)象表位的一種新方法，這種方法通過對(duì)X射線晶體衍射確定的76個(gè)抗原抗體復(fù)合物所組成的構(gòu)象表位數(shù)據(jù)集進(jìn)行大量統(tǒng)計(jì)度量、空間特征分析和表面可及性計(jì)算，對(duì)B細(xì)胞構(gòu)象性表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，最終對(duì)組成蛋白序列的每個(gè)氨基酸打分，通過

12、分值來反映某一氨基酸成為表位的可能性，并提供了閾值來確定組成表位的氨基酸殘基。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的方法除以上兩種方法之外， 還有最近發(fā)展起來的一些預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的方法。由于抗原抗體之間的相互作用屬于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用中的一種，因此，可以參這些方法來預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位。分子對(duì)接：主要用來研究分子間的相互作用與識(shí)別，進(jìn)而預(yù)測(cè)復(fù)合物結(jié)構(gòu)。常用的分子對(duì)接軟件有ZDOCK(ChenRetal.,2003)、DOT(ShoichetBKetal.,1991)、DOCK(MandellJGetal.,2001)、ClusPro(ComeauSRetal.,2004)等。其中C

13、lusPro是一個(gè)提供網(wǎng)上服務(wù)的分子對(duì)接軟件，其能夠根據(jù)形狀互補(bǔ)快速的篩選ZDOCK和DOT程序產(chǎn)生的對(duì)接結(jié)果，并對(duì)對(duì)接結(jié)果聚類，根據(jù)聚類情況對(duì)對(duì)接結(jié)果打分，最終返回10個(gè)得分最高的對(duì)接結(jié)果，再根據(jù)這些對(duì)接結(jié)果來確定蛋白質(zhì)相互作用的位點(diǎn)。PPI-Pred(BradfordJRetal.,2005)(protein-proteininterfaceprediction)將支持向量機(jī)的方法同曲面分析結(jié)合在一起預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)。ProMate(NeuvirthHetal.,2004)(Predictingthelocationofpotentialprotein-proteinbindings

14、itesforunboundproteins)是將一些蛋白質(zhì)相互作用界面的重要性質(zhì)綜合起來預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)。這些性質(zhì)包括：結(jié)合位點(diǎn)通常偏向位于3片層及非結(jié)構(gòu)的鏈；芳香族氨基酸的側(cè)鏈常會(huì)參與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用；疏水氨基酸和極性氨基酸常聚集在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的界面；以及在晶體結(jié)構(gòu)中結(jié)合位點(diǎn)的周圍有更多的水分子與之結(jié)合。Ponomarenko和Bourne采用以上幾種方法預(yù)測(cè)構(gòu)象表位并使用同一評(píng)估體系對(duì)其進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，這些方法的準(zhǔn)確性均未超過40%,如果用ROC(Relativeoperatingcharacteristic)曲線下面積的值來評(píng)估這些方法，則DiscoTop

15、e,和PPI-PRED的值大約是0.6,ClusPro的值高于0.65,但未超過0.7,而其它的方法接近于隨機(jī)預(yù)測(cè)。盡管這些年來B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)的方法得到了一定的發(fā)展和應(yīng)用，但這些研究方法還存在一定的問題。首先，所有預(yù)測(cè)表位的方法都缺乏標(biāo)準(zhǔn)的ROC(SwetsJAetal.,1988)評(píng)估，這使得各種預(yù)測(cè)方法的結(jié)果難以比較與評(píng)估；其次，大多數(shù)預(yù)測(cè)線性表位的方法都具有一定的局限性，它們僅僅是根據(jù)少數(shù)的幾個(gè)表位的特征(氨基酸的性質(zhì)，殘基的表面可及性，空間分布，分子間接觸)來預(yù)測(cè)表位，而最近對(duì)各種線性表位預(yù)測(cè)方法進(jìn)行評(píng)估的結(jié)果表明，僅根據(jù)氨基酸的性質(zhì)來預(yù)測(cè)線性表位的方法并不可靠。要想提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，

16、需將更多表位區(qū)別于非表位的特征結(jié)合起來預(yù)測(cè)；最后，目前預(yù)測(cè)表位的方法大多數(shù)是針對(duì)于線性表位的，而據(jù)研究表明(BarlowDJetal.,1986)90%以上的表位為構(gòu)象表位，因此在進(jìn)一步完善線性B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)研究的基礎(chǔ)上，從蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)入手，深入對(duì)構(gòu)象性B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)算法與程序的研究。同時(shí)，我們也相信隨著PDB數(shù)據(jù)庫中抗原抗體復(fù)合物的增加，能夠?qū)Ω鞣N抗原的構(gòu)象表位進(jìn)行更廣泛的分析，人們對(duì)蛋白質(zhì)抗原表位的研究將更加透徹。以上都是前輩們總結(jié)的，我只是借平臺(tái)和同我一樣迷茫的人們一起分享，希望有助于解決問題。但有一點(diǎn)，大多數(shù)軟件預(yù)測(cè)得到的是線性表位，需要構(gòu)像表位，最好結(jié)合噬菌體肽庫篩選。選擇抗原多肽有如下基本原則：1、盡可能是在蛋白表面2、保證該段序列不形成a-helix3、N,C端的肽段比中間的肽段更