原花青素對紫外線誘導晶狀體上皮細胞氧化損傷保護作用的研究

1、原花青素對紫外線誘導晶狀體上皮細胞氧化損傷保護作用的研究         11-03-03 13:24:00     作者：于攀，王欣玲，閻啟昌    編輯：studa20【摘要】  目的：研究原花青素(procyanidins,PC)對紫外線誘導的人晶狀體上皮細胞(len epithelial cells,LECs)DNA氧化損傷的保護作用。方法：采用照射劑量為15mJ/cm2的中波紫外線(UVB)分別照射用0(對照組)，0

2、.05，0.1，0.2mg/mL的PC，牛磺酸(TAU)，維生素C(VC)預處理的LECs，未處理組未給予紫外線和任何抗氧化劑處理，用單細胞凝膠電泳法(SCGE)檢測分析各PC組LECs DNA單鏈斷裂的程度，并與其他各組的檢測結果相比較。結果：各PC組的尾長、尾部DNA百分比、尾力矩在數(shù)值上均明顯小于對照組，且與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。各PC實驗組的尾部DNA百分比、尾力矩與未處理組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。相同濃度下，PC，TAU和VC組的各檢測指標數(shù)值逐漸增大。結論：外源性PC對UVB照射誘導損傷的人LECs DNA有保護作用。PC的保護

3、作用明顯強于TAU和VC，并且在一定濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增加其抗氧化作用逐漸增強。 【關鍵詞】  原花青素;紫外線;晶狀體上皮細胞;DNA損傷AbstractAIM: To determine the protection of procyanidins(PC) against UVBinduced oxidative damage of lens epithelial cells (LECs) with alkaline single cell gel electrophoresis, in order to provide an experimental foundation f

4、or cataract clinical treatment.METHODS: LECs lines of generation 4 were divided randomly into 5 groups. As untreated group: normal cultured LECs; control group: LECs + UVB; three treated groups: PC treated groups: LECs + PC + UVB; taurine (TAU) treated groups: LECs + TAU + UVB; VC treated groups: LE

5、Cs+VC+UVB. All groups of antioxidants were divided into 3 groups according to the final concentration from low to high (0.05, 0.1, 0.2mg/mL). Each treated group was treated by antioxidants 2 hours before irradiated under UVB, respectively, then conventional cultivation. The LECs of treated groups an

6、d control group were all irradiated at UVBdose 15mJ/cm2. All of LECs in every group were collected after treatment an hour respectively and analyzed with alkaline single cell gel electrophoresis.RESULTS: The differences of tail length, percentage of tail DNA and tail moment between PC treated groups

7、 and control group were statistically significant (P<0.01). The differences of percentage of tail DNA, tail moment in each PC treated group and untreated group were not significant (P>0.05). The results of PC treated groups were significantly smaller than those of TAU treated groups and VC tre

8、ated groups, The differences of tail length, percentage of tail DNA and tail moment in various antioxidant treated groups were statistically significant (P<0.01).CONCULSION: Exogenetic PC has protective effect to UVBinduced LECs DNA damage. The protective effect of PC is obviously stronger than t

9、hose of TAU and VC, and in a certain range of concentration, the protective effect of PC has the positive relationship of dose effect.KEYWORDS: procyanidins; ultraviolet rays; len epithelial cells;DNA damage   0引言原花青素(procyanidins，PC)是植物中廣泛存在的天然抗氧化物質，具有很強的抗氧化活性，能夠清除自由基圖1 倒置熒光顯微鏡下細胞形態(tài)學觀察 A：

10、未處理組;B：對照組;C：PC組;D：TAU組;E：VC組。以及抑制脂質過氧化反應，是低毒高效熱門的抗氧化劑。自從氧化損傷被認為是一個包括白內(nèi)障在內(nèi)的多種年齡相關疾病的共同啟動因子，用化學方法延緩白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展就顯得非常有價值1。紫外線可誘發(fā)白內(nèi)障已得到廣泛的流行病學證實2,3。晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)是晶狀體代謝最活躍的部位，可能是白內(nèi)障發(fā)生的最初位置2，而DNA是LECs受紫外線損傷最薄弱的靶子之一4，因此，尋求高效的抗氧化劑拮抗紫外線對LECs DNA的損傷將成為預防白內(nèi)障的重要手段之一。在到達眼部的紫外線中,UVB被認為生物損傷性最強,

11、可以獨立致眼部白內(nèi)障5。我們采用UVB復制的人LECs損傷模型，采用單細胞凝膠電泳法(single cell gel electrophoresis，SCGE)研究原花青素對紫外線所致LECs DNA氧化損傷的直接保護作用，以期為白內(nèi)障的臨床藥物治療提供新的途徑。1材料和方法1.1材料 細胞：人晶狀體上皮細胞系SRA01/04(購自中國科學院腫瘤研究所)。主要試劑和儀器：MEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、非必需氨基酸、胎牛血清(美國Hyclone公司)、雙抗(青霉素、鏈霉素)、正常熔點瓊脂糖凝膠、低熔點瓊脂糖凝膠(美國sigma公司)、溴化乙錠(Ethidium bromide，EB)、PC、?；撬?、V

12、C(成都生物制劑公司)、Olympus倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司BX51型)、UVB段紫外燈(美國SP公司xx15N/F型)、電泳儀(Tanon公司HE120型)。1.2方法1.2.1細胞培養(yǎng) 使用含100g/L胎牛血清、非必需氨基酸、50g/L雙抗的MEM完全培養(yǎng)液，在37，50mL/L CO2，90%濕度的孵箱中人LECs單層貼壁生長。1.2.2細胞分組及抗氧化劑處理 將LECs傳代培養(yǎng)取第4代細胞隨機分為5組。未處理組：正常培養(yǎng)的LECs;對照組：正常培養(yǎng)的LECs+UVB;實驗組：PC組：LECs+PC+UVB;TAU組：LECs+TAU+UVB;VC組：LECs+VC+U

13、VB。各抗氧化劑組按終濃度從低到高(0.05，0.1，0.2mg/mL)再分為3個亞實驗組。各實驗組于UVB照射前2h加藥，常規(guī)培養(yǎng)。1.2.3紫外線照射 紫外燈照射強度為1.5mW/cm2(每次使用前都預先經(jīng)紫外線儀器測量，避免由于衰減造成的強度不一致)，照射時間為10s，即采用的照射劑量為15mJ/cm2。取對數(shù)生長期的細胞置于暗室中紫外光源下10cm處，照射前將培養(yǎng)液棄去，用PBS輕柔沖洗2次，照射時打開培養(yǎng)皿。照射后加入完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1h，收集細胞，消化后制備單細胞懸液(稀釋成約2×104/mL)，用于檢測DNA。1.2.4堿性SCGE檢測 100L 8g/L正

14、常熔點瓊脂糖凝膠溶解后滴加在經(jīng)多聚賴氨酸預處理的載玻片上，用蓋玻片使膠均勻展開，在酒精燈上略過火，使正常熔點瓊脂糖完全凝固于載玻片上，即第1層膠。再次滴加與第一次相同的正常熔點瓊脂糖，蓋玻片使膠均勻展開后4下固化10min，為第二層膠。取混有新鮮制備細胞懸液的低熔點瓊脂糖(按13混合)100L加到第2層膠上，立即蓋上蓋玻片，4固化10min,即第3層膠。輕輕揭去蓋玻片待裂解，將凝膠載玻片浸沒于新配置的裂解液中(pH=10)裂解2h，除去細胞質。從裂解液中取出載玻片，用蒸餾水浸泡5min后移入水平電泳槽，4冰箱內(nèi)避光解旋20min(1mmol/L Na2EDTA, 300mmol/L NaOH,

15、 pH=13)。電壓25V，4冰箱內(nèi)避光條件下電泳15min。然后用PBS漂洗2次，每次5min。用5g/mL的EB避光染色10min(每張23滴)，染色后放入避光的密閉濕盒內(nèi)，24h內(nèi)進行圖像分析。染色后的凝膠板，置于倒置熒光顯微鏡下可清晰的觀察到核DNA和遷移的DNA。每個處理組隨機保存200個細胞，用單細胞凝膠電泳分析軟件TriTek CometScore進行圖像分析，計量每個細胞的尾長、尾部DNA百分比和尾力矩。每一實驗條件至少重復1次。統(tǒng)計學分析：數(shù)據(jù)資料以±s表示，應用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行隨機樣本的單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2

16、.1細胞形態(tài)學觀察 實驗中觀察到細胞分布適中，DNA較均勻，清楚地反映了細胞的損傷情況。各處理組細胞呈不同程度的彗星圖像，頭尾分明(圖1)。未處理組LECs表1 各處理組LECs尾長，尾部DNA百分比，尾力矩比較呈圓形基本無拖尾、保持較完整的擬核狀態(tài)(圖1A);對照組LECs從胞核中溢出的單鏈DNA片段最多，表現(xiàn)為尾部長度最長、熒光強度最強(圖1B);相同濃度時，PC組、TAU組和VC組LECs尾長逐漸增加，尾部熒光強度逐漸增大(圖1CE)。2.2各處理組尾長、尾部DNA百分比和尾力矩比較 各PC組尾長與對照組和未處理組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);各抗氧化劑組間比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);0.1mg/mL TAU組尾長與0.05mg/mL TAU組比較，差異無統(tǒng)計學意義。各PC組尾