低強度間斷負壓誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化

1、低強度間斷負壓誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化         11-01-09 15:46:00     編輯：studa20                 作者：楊治，劉淼，張銀剛，郭雄，許鵬【摘要】  目的 利用低強度間斷負壓誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)向成骨細胞定向分化。方法 分離人骨髓

2、，利用梯度離心法進行MSCs的培養(yǎng)，取第三代細胞利用低強度間斷負壓誘導(dǎo)分化；倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，檢測堿性磷酸酶(ALP)活性，茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成，免疫組織化學(xué)檢測型膠原和骨保護素的表達。結(jié)果 低強度間斷負壓誘導(dǎo)2周后，細胞呈現(xiàn)出成骨細胞形態(tài)，ALP活性明顯增強，茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)形成，型膠原和骨保護素表達陽性。結(jié)論 利用低強度間斷負壓可以成功的誘導(dǎo)MSCs向成骨細胞定向分化，誘導(dǎo)的細胞具有典型的成骨細胞特性。 【關(guān)鍵詞】  負壓 骨髓間充質(zhì)干細胞 成骨細胞 誘導(dǎo)ABSTRACT: Objective  To investigate the effect of

3、 low-intensity interrupted negative pressure on the differentiation of human marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into osteoblast in vitro. Methods  MSCs were isolated from adult marrow using density gradient separation method, passage 3 cells were chosen to induce differentiation; the differen

4、tiation of MSCs was examined by phase-contrast microscopy, the determination of alkaline phosphatase (ALP) activities, alizarin-red staining and the immunohistochemistry of typecollagen and osteoprotegerin. Results  MSCs showed a typical appearance of osteoblasts after 2 weeks induction by low-

5、intensity interrupted negative pressure, the activities of ALP were increased significantly, calcium nodes were seen by alizarin-red staining, the expressions of collagen type and osteoprotegerin were positive. Conclusion  Low-intensity interrupted negative pressure could successfully induce hu

6、man MSCs into osteoblasts and the induced cells show characteristics of osteoblasts.KEY WORDS: negative pressure; marrow mesenchymal stem cell; osteoblast; induction近年來，負壓封閉引流技術(shù)(vacaum assisted closure, VAC)在外科創(chuàng)面處理方面取得了巨大的成功，該項技術(shù)能改善創(chuàng)面血供促進創(chuàng)面愈合1。負壓技術(shù)對骨組織有何作用以及作用的機制如何，能否用來促進骨折愈合、治療骨壞死等方面，國內(nèi)外尚無學(xué)者對其進行研究。

7、本研究在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上通過觀察低強度間斷負壓對人骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)誘導(dǎo)分化的影響，以闡述其作用機制，為今后在骨折愈合和骨壞死方面的研究提供理論依據(jù)。1  材料與方法1.1  材料 骨髓2例取自我科診斷為髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎，行人工關(guān)節(jié)置換的手術(shù)患者，年齡分別為56歲和61歲。兩例患者肝腎功能正常，無代謝性骨病及傳染病，手術(shù)前經(jīng)患者同意，術(shù)中截骨后經(jīng)骨髓腔抽取骨髓5mL，吸入預(yù)先加有肝素的針筒備用。1.2  主要試劑與儀器 L-DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均為Gibco產(chǎn)品，Percoll分離液為

8、Sigma產(chǎn)品(1.073 g/mL)，胎牛血清(杭州四季青)，型膠原和骨保護素免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，完全培養(yǎng)基的組成：L-DMEM培養(yǎng)基加入100 mL/L胎牛血清，青、鏈霉素終濃度為100 u/mL，微型負壓儀。1.3  細胞原代培養(yǎng) 細胞采用梯度離心法進行培養(yǎng)：將抽取的骨髓分裝入離心管，加入 L-DMEM培養(yǎng)基2 mL，1 500 r/min離心5 min去除上層脂肪滴和上清，以D-Hanks液重懸細胞后平鋪于Percoll分離液上，1 500 r/min離心10 min，吸取中間層的白膜層(單核細胞層)，以D-Hanks液洗滌，加入L-DME

9、M培養(yǎng)基置入無菌培養(yǎng)瓶中，37 、5%(體積分數(shù))的CO2孵育箱培養(yǎng)。1.4  負壓誘導(dǎo)  取第三代細胞進行負壓誘導(dǎo)，把24孔和6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)液預(yù)先吸掉4/5，打開蓋置入自行設(shè)計的無菌密閉容器中，容器側(cè)面有孔和導(dǎo)管與微型負壓儀相連，打開負壓儀設(shè)置壓力為20 kPa，30 min/次，2次/d。每次誘導(dǎo)完畢后取出培養(yǎng)板補足培養(yǎng)液，實驗分為負壓誘導(dǎo)組和正常培養(yǎng)組。1.5  細胞觀察倒置顯微鏡下每日觀察細胞的生長情況和形態(tài)特點，拍照記錄。1.6  堿性磷酸酶活性的測定 誘導(dǎo)2周后，兩組細胞用考馬斯亮蘭微板法測定每孔中細胞蛋白含量，采用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)試劑盒測定細胞ALP活性，定量測定兩組細胞中平均每毫克蛋白質(zhì)的ALP活性變化，比較兩組的差異。1.7  茜素紅染色 誘導(dǎo)2周后，倒掉培養(yǎng)液，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3遍，茜素紅染色8 h，顯微鏡下觀察陽性結(jié)果。1.8  免疫組織化學(xué)檢測型膠原和骨保護素的表達  誘導(dǎo)2周后，細胞用40 g/L多聚甲醛