顯微鏡的使用和微生物鑒定

1、下次仍要帶預(yù)習(xí)報(bào)告來，概括的寫就可以了，目的、原理、構(gòu)造、使用操作步驟寫寫 就可以了。本周二督導(dǎo)來查過，下周有可能還要來。實(shí)驗(yàn)三顯微鏡的使用和微生物鑒定一、實(shí)臉目的1. 了解普通生物顯微鏡的分類、構(gòu)造、工作原理及普通生物顯微鏡的使用、維護(hù)方法。2. 學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法，熟悉幾種常見微生物的基本形態(tài)。二、基本原理微生物學(xué)研究用的顯微鏡通常有低倍物鏡(16mm ,10 X)、高倍物鏡(4mm, 40-45 X)和油鏡(1.8 mm , 95-100 X)三種。油鏡常在鏡筒外標(biāo)有白圈，它是三者中放大倍數(shù)最大的。使用油鏡時(shí)，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與接物鏡之間，不是隔一層空氣，而是隔一

2、層油質(zhì)，稱為油浸系。這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率 n = 1.52與玻璃基本相同。當(dāng)光線通過載玻片后，可直接通過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射。如果玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，則稱為干燥系；當(dāng)光線通過玻片后， 受到折射發(fā)生散射現(xiàn)象，進(jìn)入物鏡的光線顯然減少，這樣視野的照明度就減低了(圖I )。圖1接物鏡和標(biāo)本之間不同折射率時(shí)的光線通路(A:空氣，B :香柏油)顯微鏡的分類：目前，顯微鏡根據(jù)結(jié)構(gòu)和原理不同主要分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡，它們中又分成幾種類型。光學(xué)顯微鏡有明視野顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡、偏光顯微鏡和立體顯微鏡等。明視野顯微鏡一一普通生物顯微鏡暗視野顯微鏡一一利

3、用特殊的集光器， 不使被照射物體的光線直接射入物鏡， 我們看到 的是檢測(cè)物體表面散發(fā)的散射光而觀察到物體， 所以實(shí)際是在暗視野中見到明亮的物象。 這 樣可以觀察比較透明的活的微生物，省去染色等步驟，能比較清楚的觀察微生物的形態(tài)。相差顯微鏡人眼能觀察物體主要是物體所散發(fā)出的光線，光具有波粒二相性。波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的是顏色，振幅對(duì)應(yīng)亮度。普通生物顯微鏡觀察物體時(shí)的染色就是改變被觀察物體的波 長(zhǎng)。但染色時(shí)，通常會(huì)破壞微生物內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，如果不染色，它有時(shí)無法和它周圍環(huán)境相區(qū)分。我們利用透明物體不能改變波長(zhǎng)和振幅，但能改變相位的特性，相差顯微鏡把光線分解成直射光和衍射光，使之相互干涉，即能區(qū)分明暗，觀察到物體。

4、熒光顯微鏡一一主要用于微生物內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察。一般通過熒光染色劑使特殊結(jié)構(gòu)在特殊光源下發(fā)光，以便觀察。倒置顯微鏡一一主要用于觀察需要進(jìn)一步生長(zhǎng)的活的微生物或動(dòng)植物細(xì)胞。電子顯微鏡利用光線波長(zhǎng)的變化，主要用于觀察微生物內(nèi)部的結(jié)構(gòu)。三、實(shí)驗(yàn)器材1 儀器：普通生物顯微鏡2 .材料：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、曲霉、青霉等標(biāo)本片、香柏油、二 甲苯或乙醚-乙醇混合液（70: 30）、擦鏡紙。四、操作步驟和內(nèi)容1 普通生物顯微鏡的一般構(gòu)造光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)如圖2,都可分為光學(xué)系統(tǒng)和機(jī)械系統(tǒng)兩大部分，只有在光學(xué)和機(jī)械二系統(tǒng)良好的配合下才能發(fā)揮顯微鏡的性能，因此要正確掌握顯微鏡的用法，必須了解顯微

5、鏡的結(jié)構(gòu)和原理。機(jī)械部分一一鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、推進(jìn)器、粗調(diào)（10mm/圈）、微調(diào)（0.1mm/圈）光學(xué)部分一一反光鏡、聚光鏡、光圈、物鏡（10X、40X、100X）、目鏡（5X、10X、16X）,較好的顯微鏡還有光源。鏡座是顯微鏡的基座，使顯微鏡能平穩(wěn)地放置在桌子上。載物臺(tái)是放置標(biāo)本的地方，通常為方形或圓形。 鏡臺(tái)上有壓片夾用的固定被檢標(biāo)本，較好的顯微鏡則有標(biāo)本移動(dòng)器，轉(zhuǎn)動(dòng)螺旋可使標(biāo)本前后和左右移動(dòng)。有的標(biāo)本移動(dòng)器帶有游標(biāo)尺，可指明標(biāo)本所在位置。鏡臂用以支持鏡筒，也是移動(dòng)顯微鏡時(shí)手握的部位。鏡筒是連接目鏡和物鏡的金屬筒。鏡筒上端插入目鏡，下端與物鏡轉(zhuǎn)換器相接。物鏡轉(zhuǎn)換器安裝

6、在鏡筒的下端，其上裝有3-5個(gè)不同放大倍數(shù)的物鏡， 可以通過轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器物鏡。調(diào)解器安裝在鏡臂基部，是調(diào)節(jié)物鏡與被檢標(biāo)本距離的裝置，通過轉(zhuǎn)動(dòng)粗、細(xì)調(diào)節(jié)螺旋便可清晰地到標(biāo)本。目鏡一般由兩塊透鏡組成。 上面一塊稱接目透鏡， 下面一塊稱場(chǎng)鏡。 在兩塊透鏡中間或 場(chǎng)鏡的下方光闌。 在進(jìn)行顯微測(cè)量時(shí)， 接目測(cè)微尺便要放在視場(chǎng)光闌上. 不同的目鏡上刻有 5X、10X、15X或20X等字符以表示該目鏡的放大倍數(shù)。 可根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)哪跨R使用。物鏡是顯微鏡中很重要的光學(xué)部件，由多塊透鏡組成。根據(jù)物鏡的放大倍數(shù)和使用方法的不同，分為低倍物鏡、高倍物鏡和油鏡三類，低倍物鏡有4X、10X、20X。高倍物鏡有40

7、X 和 45 X 等。油鏡有 90 X、95X 和 100X 等。聚光鏡（又稱聚光器）安裝在鏡臺(tái)下，是由多塊透鏡構(gòu)成， 其作用是把平行的光線聚焦于標(biāo)本上，增強(qiáng)照明度。聚光鏡的焦點(diǎn)必須在正中，使用聚光鏡上的調(diào)節(jié)器可以進(jìn)行調(diào)中。通過轉(zhuǎn)動(dòng)手輪調(diào)節(jié)聚光鏡的上下，以適應(yīng)使用不同厚度的載玻片，也能保證焦點(diǎn)落在被檢標(biāo)本上。但因聚光鏡的焦距短， 載破片也不能太厚， 一般以0.9-1.3mm之間為宜。聚光鏡上附有虹彩 光闡（俗稱光圈），通過調(diào)整光闌孔徑的大小，可以調(diào)節(jié)進(jìn)入物鏡光線的強(qiáng)弱。反光鏡是普通光學(xué)顯微鏡的取光設(shè)備，使光線射向聚光鏡、它一面是凹面鏡，另一面是平面鏡。有聚光鏡的顯微鏡，無論使用低倍或高倍物鏡均

8、應(yīng)用平面鏡，只在光量不足時(shí)才使用凹面鏡。沒有聚光鏡的顯微鏡，低倍物鏡時(shí)用平面鏡，高倍物鏡及油鏡均用凹面鏡。內(nèi)光源是較好的光學(xué)顯微鏡自身帶有的照明裝置，安裝在鏡座內(nèi)部，由強(qiáng)光燈泡發(fā)出的光線通過安裝在鏡座上的集光鏡射入聚光鏡。集光鏡上有一視場(chǎng)光闌，可改變照明視場(chǎng)的大小。集光鏡上可放置不同顏色的濾光片，以改變進(jìn)入聚光鏡光線的波長(zhǎng)。圖2光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造1.物鏡轉(zhuǎn)換器 2.接物鏡3.游標(biāo)卡尺4.載物臺(tái)5.聚光器6.彩虹光闌7.光源8.鏡 座9電源開關(guān)10.光源滑動(dòng)變阻器 11粗調(diào)螺旋12微調(diào)螺旋13鏡臂14.鏡筒15. 目 鏡2.顯微鏡的放大倍數(shù)與分辨率這是顯微鏡的兩個(gè)重要參數(shù)。放大倍數(shù)一一目鏡倍數(shù)X物

9、鏡倍數(shù)分辨率R （resolution）指顯微鏡能夠辨別兩點(diǎn)之間最小距離的能力。它與物鏡的數(shù)值孔徑NA成正比，與入射光的波長(zhǎng)入成反比。因此，物鏡的數(shù)值孔徑越大，光波波長(zhǎng)就越短，則顯微鏡的分辨率越大，被檢物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)也越能明晰地區(qū)分出來。因此，一個(gè)高的分辨率意味著一個(gè)小的可分辨距離，這兩個(gè)因素是成反比關(guān)系的，通常有人把分辨率說成是多少 卩m或nm,這實(shí)際上把分辨率和最小分辨距離混淆起來了。顯微鏡的分辨率是用可分辨的 最小距離D來表示的。扎1D =R =2NA式中：入是光波波長(zhǎng);NA是數(shù)值孔徑，指光線投射到物鏡時(shí)，入射光線與折射光線之間的最大夾角(稱為鏡3,可用下列公式表口角)的一半正弦乘上玻片

10、與物鏡間介質(zhì)的折射率所得的乘積，如右圖 示:NA = n sin 2n =介質(zhì)折射率；a=最大入射角，即鏡口角。3圖3物鏡的光線入射角1 .物鏡前透鏡2 .載玻片a.入射因此，光線投射到物鏡的角度越大，顯微鏡的效能就越大，該角度的大小決定于物鏡的直徑和焦距。同時(shí)，a的理論限度為180 , si na /2最大值為1。空氣的折射率 n = 1,水的折射率n=1.33，玻璃的折射率n =1.52。因?yàn)橄惆赜偷恼凵渎?n =1.515，很接近玻璃的折 射率。當(dāng)光線通過載玻片后，幾乎直接通過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射。如果玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，當(dāng)光線通過載玻片后，受折射發(fā)生散射現(xiàn)象， 進(jìn)入物鏡的

11、光線顯然減少，這就降低了視野的照明度。利用油鏡不但能增加照明度，更主要能增加數(shù)值孔徑， 提高顯微鏡的分辨率。圖4物鏡的主要參數(shù)3顯微鏡的使用方法(1) 取鏡顯微鏡是光學(xué)精密儀器， 使用時(shí)應(yīng)特別小心。 從鏡箱中取出時(shí)，一手握鏡臂，一手托鏡 座，放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。在使用時(shí)要特別小心。 使用前首先要熟悉顯微鏡的結(jié)構(gòu)和性能， 檢查各 部零件是否完全合用，鏡身有無塵土，鏡頭是否清潔。做好必要的清潔和調(diào)整工作。(2 )調(diào)節(jié)光源0.5cm左右。a. 將低倍物鏡旋到鏡筒下方，旋轉(zhuǎn)粗調(diào)螺旋，使鏡頭和載物臺(tái)距離約為b. 上升聚光器，使之與載物臺(tái)表面相距l(xiāng)mm左右。c. 左眼看目鏡調(diào)節(jié)反光鏡鏡面角度（在天然的光線下觀察

12、，一般用平面反光鏡；若以燈光為光源，則一般多用凹面反光鏡），開閉光圈，調(diào)節(jié)光線強(qiáng)弱，直至視野內(nèi)得到最均勻最適宜的照明為止。 一般染色標(biāo)本油鏡檢查時(shí)，光度宜強(qiáng)，可將光圈開大， 聚光器上升到最高，反光鏡調(diào)至最強(qiáng)；未染色標(biāo)本，在低倍鏡或高倍鏡觀察時(shí)，應(yīng)適當(dāng)?shù)乜s小光圈，下降聚 光器，調(diào)節(jié)反光鏡，使光度減弱，否則光線過強(qiáng)不易觀察。（3）低倍鏡觀察低倍物鏡（8x或10X）視野面廣，焦點(diǎn)深度較深，為易于發(fā)現(xiàn)目標(biāo)確定檢查位置，故應(yīng)先用低倍鏡觀察為宜。操作步驟：a. 先將標(biāo)本玻片置于載物臺(tái)上（注意標(biāo)本朝上），并將標(biāo)本部位處于物鏡的正下方、轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)螺旋，上升載物臺(tái)使物鏡距標(biāo)本約0. 5cm處。b. 左眼看目鏡，同

13、時(shí)順時(shí)針方向慢慢旋轉(zhuǎn)粗調(diào)節(jié)螺旋使載物臺(tái)緩慢上升，至視野內(nèi)出現(xiàn)物象后，仔細(xì)調(diào)節(jié)焦距和照明，直至視野內(nèi)獲得清晰的物象，及時(shí)確定需進(jìn)一步觀察的部位。c. 移動(dòng)推動(dòng)器。將所要觀察的部位置于視野中心，準(zhǔn)備換高倍鏡觀察。（4）高倍鏡觀察將高倍物鏡（40X ）轉(zhuǎn)至鏡筒下方（在轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)，要從側(cè)面注視。以防低倍鏡未對(duì)好焦距而造成鏡頭與玻片相撞），調(diào)節(jié)光圈和聚光鏡，使光線亮度適中，再仔細(xì)反復(fù)轉(zhuǎn)動(dòng)微調(diào) 螺旋，調(diào)節(jié)焦距，獲得清晰物象，再移動(dòng)推動(dòng)器選擇最滿意的鏡檢部位將染色標(biāo)本移至視野 中央，待油鏡觀察。（5 ）油鏡觀察a. 調(diào)螺旋提起鏡筒，轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器將油鏡轉(zhuǎn)至鏡筒正下方。在標(biāo)本鏡檢部位滴上一滴香柏油。右手逆時(shí)針方向

14、慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)螺旋，上升載物臺(tái)，并及時(shí)從側(cè)面注視使油鏡浸入油中，直到幾乎與標(biāo)本接觸時(shí)為止（注意切勿壓到標(biāo)本，以免壓碎玻片，甚至損壞油鏡頭）。b. 左眼看目鏡，右手順時(shí)針方向微微轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)螺旋，下降載物臺(tái)（注意：此時(shí)只準(zhǔn)下降載物臺(tái)，不能向上調(diào)動(dòng)），當(dāng)視野的標(biāo)本物象時(shí)，改用微調(diào)螺旋，并移動(dòng)標(biāo)本直至標(biāo)本物 象清晰為止。c. 如果向上轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)螺旋已使鏡頭離開油滴又尚未發(fā)現(xiàn)標(biāo)本時(shí)，可重新按上述步驟操作直到看清物象為止。d. 觀察完畢，下降載物臺(tái)，取下標(biāo)本片。先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾少量二甲苯擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。切忌用手或其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭，可用綢布擦

15、凈顯微鏡的金屬部件。e. 將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋。罩上鏡套，然后放回鏡箱中。4 .幾點(diǎn)使用技巧：（1）檢查看到的是否是標(biāo)本，只要移動(dòng)玻片標(biāo)本，如果物象隨著標(biāo)本移動(dòng)，就可證明 觀察到的是否是標(biāo)本。（2）如果在觀察標(biāo)本時(shí)，無論如何調(diào)整焦距都得不到清晰的圖象，試將物鏡拿下，重 新用二甲苯擦拭后再觀察。（3）般情況下，物鏡與標(biāo)本的距離為低倍鏡：7.63mm、高倍鏡0.50mm、油鏡0.098mm。（4）在調(diào)節(jié)焦距時(shí)，如果顯微鏡的各個(gè)鏡頭是原配，在低倍鏡調(diào)節(jié)好時(shí)，直接轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn) 換器，在高倍鏡和油鏡下基本已經(jīng)達(dá)到合適焦距，只要調(diào)節(jié)微調(diào)即可。5顯微鏡的維護(hù)搬動(dòng)顯微鏡時(shí)，必須一手持鏡臂，一手托住鏡座，切不可單手斜持。避免使用手、粗糙 的紙、布等去擦拭鏡面，如有灰塵需用擦鏡紙或綢布拭擦，如沾油請(qǐng)用鏡紙沾少量二甲苯擦凈