產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶細菌的研究近況

1、產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺酶細菌的研究近況    產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺酶細菌的研究近況    國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊1999年第20卷第1期    解放軍總醫(yī)院微生物科（北京 100853）沈定霞周貴民綜述    摘要超廣譜內(nèi)酰胺酶是近年來發(fā)現(xiàn)的對三代頭孢類抗生素耐藥的主要原因。本文從 eSBLs的類型和作用、產(chǎn) eSBLs細菌的種類、臨床檢測、對抗生素的敏感性及醫(yī)院感染暴發(fā)流行的關(guān)系諸方面進行了綜述。對理解細菌對頭孢類抗生素的耐藥機制，正確選

2、擇抗生素進行治療以及控制醫(yī)院產(chǎn) eSBLs細菌引起的暴發(fā)感染等均有重要意義。    關(guān)鍵詞：細胞；超廣譜內(nèi)酰胺酶；抗生素    內(nèi)酰胺酶是細菌最常產(chǎn)生的、能水解內(nèi)酰胺類抗生素的一種酶，是細菌對內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因。隨著三代頭孢菌素的問世及在臨床上日益廣泛的應(yīng)用，出現(xiàn)了對這些新一代內(nèi)酰胺類藥物耐藥的細菌。導(dǎo)致細菌對此類藥物耐藥的主要原因是細菌染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜內(nèi)酰胺酶（ extended spectrum lactamases, ESBLs）的產(chǎn)生。目前產(chǎn) eSBLs細菌在臨床標本中的分離率有增加

3、趨勢，由其引起的醫(yī)院暴發(fā)感染也時有報道1，3。故弄清產(chǎn) eSBLs細菌的種類，建立其檢測方法，了解產(chǎn) eSBLs細菌在醫(yī)院的流行，對理解細菌的耐藥機制，選擇適當(dāng)抗生素進行治療以及探索新藥研制途徑等均有重要意義，現(xiàn)就這方面的研究近況綜述如下。    1 ESBLs的類型和作用    根據(jù)來源的不同， eSBLs分染色體介導(dǎo)產(chǎn)生和質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生兩大類。質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的 eSBLs的主要類型是 tEM類和 eHV類酶，它們分別由內(nèi)酰胺酶 tEM-1、 tEM-2和 sHV-1基因發(fā)生單個點突變或多個點突變，從而導(dǎo)致1個或多個

4、氨基酸改變而來。迄今為止， tEM類 eSBLs由 tEM-3增加到 tEM-46， sHV類 eSBLs也由 sHV-2增加到 sHV-124。附表列出了幾種常見 tEM類和 sHV類 eSBLs的氨基酸改變。臨床實驗室還在不斷發(fā)現(xiàn)新的 tEM類和 sHV類 eSBLs。    tEM類和 sHV類酶具有相同的生物學(xué)活性，即水解內(nèi)酰胺類抗生素如青霉素和頭孢類抗生素， tEM類和 sHV類 eSBLs的作用底物更廣，已擴大到三代頭孢類抗生素和氨曲南。 tEM類 eSBLs在大腸桿菌中較多見，而 sHV類 eSBLs在肺炎克雷伯菌中較多見。這兩種類型的酶通

5、常可被酶抑制劑棒酸等所抑制。染色體介導(dǎo)的 eSBLs主要有 ampC類，存在于大腸桿菌中，具有 ampC基因來源的 mIP-1主要見于肺炎克雷伯菌，他們能水解頭霉素，但耐受酶抑制劑的作用。另有一少見 eSBLs類型為對酶抑制劑耐藥的 tEM類內(nèi)酰胺酶（ inhibitor-resistant tEM-lactamases, iRT）。 iRT對酶抑制劑耐受的原因是由于其與內(nèi)酰胺酶活性部位相鄰的67位的甲硫氨酸被其它氨基酸取代，從而降低了對酶抑制劑的親和力所致。    2產(chǎn) eSBLs細菌的種類    1983年德國

6、學(xué)者首先發(fā)現(xiàn)對廣譜頭孢菌素耐藥的肺炎克雷伯菌5，之后，法國、美國、意大利、中國香港等許多國家和地區(qū)相繼報道了產(chǎn) eSBLs細菌的出現(xiàn)68。一般說來， eSBLs多由腸桿菌科細菌產(chǎn)生，其中以肺炎克雷伯菌及大腸桿菌為主，其次是產(chǎn)氣腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌，并可見于產(chǎn)酸克雷伯菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、陰溝腸桿菌和腸炎沙門菌等911。由于三代頭孢類藥物在醫(yī)院和社區(qū)的廣泛使用，在藥物選擇性壓力影響下，勢必產(chǎn)生相應(yīng)耐藥菌侏甚至新的耐藥菌種，臨床微生物實驗室應(yīng)重視對這類耐藥菌的檢測，才能了解其流行趨勢，從而指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗生素。    3產(chǎn) eSBLs細菌的檢測 &

7、#160;  由于許多產(chǎn) eSBLs的細菌對常用檢測 eSBLs的藥物如頭孢噻肟和頭孢三嗪敏感，故僅根據(jù)常規(guī)細菌藥敏試驗的結(jié)果判定標準不能正確檢出產(chǎn) eSBLs的細菌，而必須采用特殊的試驗方法?，F(xiàn)將幾種用于檢測細菌 eSBLs的方法簡述如下。    3.1雙紙片協(xié)同試驗（ double disk synergy test, DDS）此試驗是由法國研究者 jarlier等建立的12。其原理是產(chǎn) tEM類和 sHV類 eSBLs對三代頭孢類藥物如頭孢他啶耐藥，但能被酶抑制劑如棒酸所抑制，故做紙片法藥敏試驗時將單純?nèi)^孢類藥及其含酶抑制物

8、的聯(lián)合劑的兩種紙片以適當(dāng)距離貼放，在兩種紙片各自產(chǎn)生的抑菌圈間另產(chǎn)生一抑菌圈，3個抑菌圈相連形似葫蘆狀。此法簡便，成本低，對產(chǎn) eSBLs細菌的檢出率為98.1%13，但只能檢測 tEM-12以外的 tEM類和 sHV類的 eSBLs，不能檢測 ampC類 eSBLs14，而且，兩種紙片間距離對結(jié)果影響很大，當(dāng)受試紙片本身抑菌圈大時，兩紙片間的距離應(yīng)適當(dāng)增加，反之亦然。有時為了選擇最佳距離，需要進行幾次調(diào)整。    3.2三維試驗（ three dimensional test）由 thomason和 sander創(chuàng)立15，較雙紙片協(xié)同試驗結(jié)果可靠，但操

9、作較繁瑣。不能常規(guī)應(yīng)用于臨床微生物實驗室。    3.3 E-test采用 aB bIODISC公司生產(chǎn)的一端含頭孢他啶另一端含頭孢他啶及棒酸的試條，通過測定兩者 mIC值進行判斷。如待檢菌對頭孢他啶耐藥或頭孢他啶與頭孢他啶+克拉維酸的 mIC值之比16o eSBLs陽性，4為陰性，8為可疑14。此法操作簡便，結(jié)果準確，但有時棒酸從試條擴散致使對側(cè)的抑菌環(huán)變形， mIC值不能讀取，此時應(yīng)另外單獨檢測頭孢他啶的 mIC值。    3.4 Vitek機器鑒定采用法國 biomeriux的 vitek機器及其藥敏卡，通過

10、測定 cefotaxime和頭孢他啶及他們與酶抑制劑棒酸的聯(lián)合制劑對待檢菌的抑制作用而進行測定13，當(dāng)含棒酸的聯(lián)合制劑與單純頭孢三代類藥物比較，前者使細菌生長受到明顯抑制為 eSBLs陽性。此法需用 vitek機器及相應(yīng)的藥敏卡，對產(chǎn) eSBLs細菌的檢出率為99.5%13。    在檢出產(chǎn) eSBLs細菌基礎(chǔ)上，根據(jù) eSBLs的等電點差異可行等電聚焦電泳或根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計引物進行 pCR及序列測定，可進一步確定 eSBLs的類型。    目前尚無令人滿意的統(tǒng)一方法用于產(chǎn) eSBLs細菌的檢測，由于細菌攜帶

11、eSBLs質(zhì)粒的可傳遞性，能使耐藥菌在醫(yī)院內(nèi)蔓延擴散。故有必要盡快建立標準方法檢測產(chǎn) eSBLs細菌，以幫助臨床醫(yī)生對這類細菌感染病人進行治療和管理。    4產(chǎn) eSBLs細菌與醫(yī)院感染暴發(fā)流行    已有多起關(guān)于產(chǎn) eSBLs細菌引起醫(yī)院感染暴發(fā)流行的報告2，3，16，17，多數(shù)引起暴發(fā)流行的產(chǎn) eSBLs細菌分離自重癥監(jiān)護病房、兒科病房及腫瘤科病房，產(chǎn) eSBLs細菌所致的感染暴發(fā)流行的發(fā)生與病人較多使用三代頭孢類抗生素及全身抵抗力減低有關(guān)。而且由于 eSBLs可由質(zhì)粒攜帶，很容易在細菌間傳遞擴散，導(dǎo)致地抗生

12、素耐藥細菌的廣泛傳播，因此，盡管檢出產(chǎn) eSBLs細菌，有助于控制此類耐藥菌及其耐藥質(zhì)粒的傳播。    5產(chǎn) eSBLs細菌感染與臨床抗生素的選用    產(chǎn) eSBLs細菌對三代頭孢類藥物均耐藥，即使個別三代頭孢類抗生素的體外藥敏試驗結(jié)果敏感，但體內(nèi)效果不佳，不宜使用。另外由于攜帶 eSBLs的質(zhì)粒上可同時攜帶對氨基糖甙類和喹諾酮類等多種藥物耐藥的基因，故產(chǎn) eSBLs細菌可同時表現(xiàn)出對這兩類藥物的耐受。對除 iRT類以外的 tEM類和 sHV類產(chǎn) eSBLs細菌引起的感染，可使用含有-內(nèi)酰胺類抑制劑的聯(lián)合制劑，如

13、阿莫西林+棒酸；氧哌嗪青霉素+他唑巴坦等。有作者指出在治療 sHV類 eSBLs細菌感染時，棒本比舒巴坦的抑制作用強18。體外藥敏試驗證明，幾乎所有產(chǎn) eSBLs細菌目前對泰能敏感，必要時可選擇使用。    附表幾種 tEM類和 sHV類 eSBLs的氨基酸改變            內(nèi)酰胺酶    氨基酸位置       &#

14、160;    37    102    162    235    236    237    261            tEM-1     gln

15、60;    glu     arg     ala     gly     glu     thr            tEM-2     lys     

16、                               tEM-3     lys     lys         

17、;    ser                    tEM-5             ser     thr        

18、 lys                tEM-6         lys     his                   &

19、#160;        tEM-7     lys         ser                           

20、 tEM-8     lys     lys     ser         ser                    tEM-9    

21、0;    lys     ser                 met            tEM-10           

22、0; ser             lys                tEM-12     gln         ser      

23、                      tEM-15         lys             ser     

24、0;              tEM-16     lys     lys     his                    

25、0;       tEM-19                     ser                    tEM-24

26、     lys     lys     ser     thr         lys                tEM-26     lys 

27、    ser                                    37    102    162 

28、   201    234    235    261            sHV-1     gln     asp     arg     arg 

29、60;   gly     glu     leu            sHV-2                     ser    

30、                sHV-3                 leu     ser            

31、;        sHV-4             leu     ser     lys                   

32、 sHV-5             arg     ser     lys                    注：本表摘自文獻4，略有增加。 ala=丙氨酸； asp=天冬氨酸； gl

33、n=谷氨酰胺； glu=谷氨酸； gly=甘氨酸； his=組氨酸； leu=亮氨酸； lys=賴氨酸； met=甲硫氨酸； ser=絲氨酸； thr=蘇氨酸。    參考文獻    1 Donald JL, Olaf S, Folorunso AB, et al. Scand J Infect Dis,1996;suppl,101:17-20    2 Naumovski L, Quinn JP, Miyashiro D, et al. Antimicrob Agents

34、Chemother,1992;36:1991-1996    3 Meyer KS, Urban C, Eagen JA, et al. Ann Intern Med, 1993;119:353-358    4 Moosdeen F. CID, 1997;24:487-492    5 Knothe H, Shah P, Kremery V, et al. Infection, 1983;11:315-317    6 Nicolas MH, Jarllier V, Honore N, et al. Antimicrob Agents Chemother,1989;33:096-2100    7 Jacogy GA and Medeiros AA. Antimicrob Agents Chemother, 1991;35:1697-1704    8 Marchese A, Arlet G