高效液相色譜_電噴霧質(zhì)譜法測定血漿中曲美他嗪濃度

1、高效液相色譜/電噴霧質(zhì)譜法測定血漿中曲美他嗪濃度焦陽1蘇明明1陳閩軍31賈偉1陶萍2仇益群3黃仲義31(上海交通大學藥學院,上海2002402(上海交通大學分析測試中心,上海2000303(上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院,上海200040摘要建立了高效液相色譜/電噴霧質(zhì)譜法(HP LC /ESI 2MS 測定人血漿中曲美他嗪濃度。以利多卡因為內(nèi)標,樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白,取上清液用三氟乙酸酸化后,50真空離心,濃縮至干,流動相溶解后進樣。色譜柱:W aters Xterra M S C 18(150mm ×4.6mm,5m ,柱溫:40,流動相:pH 2.00的三氟乙酸溶液2甲醇(6040,V /

2、V ,流速:0.6mL /m in;電噴霧離子源,四級桿質(zhì)譜檢測器,選擇離子監(jiān)控模式,檢測離子的質(zhì)核比分別是235(利多卡因和267(曲美他嗪。曲美他嗪的線性范圍為2.5100g/L,檢出限2.5g/L;日間、日內(nèi)相對標準差均小于7%;相對回收率96.45%103.03%,提取回收率72.45%80147%。關鍵詞曲美他嗪,高效液相色譜2電噴霧質(zhì)譜,血漿,藥代動力學2006206228收稿;2006211214接受3E 2mail:cm jsjtu .edu .cn1引言曲美他嗪(萬爽力,Tri m etazidine 是臨床治療心肌能量代謝紊亂的有效藥物之一1,它能夠選擇性抑制線粒體氧化32

3、酮酰輔酶A 硫解酶的活性,將氧化代謝底物由脂肪酸轉(zhuǎn)向葡萄糖,從而顯著提高心臟三磷酸腺苷水平,起到保護缺血心肌細胞作用2。血漿中曲美他嗪濃度的測定方法有高效液相色譜法(HP LC 3、高效液相色譜熒光檢測法(HP LC /F D 4、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC /MS 5和高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(HP LC /MS/MS 6,7。HP LC 的檢測靈敏度很難滿足臨床藥代動力學的要求;HP LC /F D 和GC /MS 法都需要衍生化,導致樣品前處理繁瑣,不利于大樣本量檢測。本研究建立的HP LC /ESI 2MS 法測定血漿中曲美他嗪濃度,樣品前處理簡捷,測定快速、準確,可滿足臨床人體藥代

4、動力學及血樣濃度檢測的要求。2實驗部分2.1儀器與試劑1100系列LC 2MS,包括G1312A 型二元高壓泵、G1322型在線脫氣儀、G1313A 型自動進樣器、G1316A 型柱溫箱、G1315A 型二極管陣列檢測器、1946A 型四級桿電噴霧質(zhì)譜檢測器和LC /MS D Che m 2Stati on 工作站(美國安捷倫公司;W aters Xterra MS C 18(150mm ×4.6mm ,5m 色譜柱(S N:024*,W aters 。LNG 2T88真空離心濃縮儀(江蘇太倉華美生化儀器廠。利多卡因(中國藥品生物制品檢定所,批號:1003422200402;甲醇為色

5、譜純(德國Merck 公司;其它試劑均為分析純(上海潤捷化學公司;實驗用水為超純水(M illi pore 超純水系統(tǒng);方法學驗證中所用健康人血漿(上海市血液中心,批號:3365297。2.2儲備液的制備稱取兩份20.00mg 曲美他嗪對照品,分別置于50mL 容量瓶中,流動相溶液溶解并定容至刻度,得0.4g/L 曲美他嗪儲備液和質(zhì)控儲備液。稱取25.00mg 利多卡因標準品,加流動相溶液溶解并定容至25mL,得1.0g/L 利多卡因儲備溶液。以上3種溶液均置于4冰箱避光保存。用流動相分別稀釋曲美他嗪儲備液至1000、800、400、200、100、50和25g/L,作曲美他嗪工作液;另用流動

6、相分別稀釋質(zhì)控儲備液至800、200和50g/L,作質(zhì)控溶液;用流動相稀釋利多卡因儲備溶液至1000g/L,作內(nèi)標工作液。第35卷2007年4月分析化學(FE NX I HUAXUE 研究簡報Chinese Journal of Analytical Che m istry 第4期5415442.3HP LC/ES I2M S分析條件流動相為甲醇2pH2.00的三氟乙酸溶液(4060,V/V,流速0.6mL/m in,柱溫40,進樣量90L。電噴霧離子源,霧化氣(N2壓力208kPa,干燥氣(N2的流速和溫度分別設為9.0L/m in和350,毛細管電壓4.0k V;選擇離子監(jiān)測模式,檢測離子

7、質(zhì)荷比為235(利多卡因和267(曲美他嗪,裂解電壓70V。2.4生物樣品前處理精確吸取500L血樣置于5mL具塞玻璃離心管中,精確加入50L內(nèi)標工作液,混勻;再加入1mL甲醇,渦旋振蕩30s,以3000r/m in離心8m in;小心吸取上清液至2mL離心管中,加入30L三氟乙酸溶液(15,V/V,混勻后置真空離心濃縮儀中,50揮干,用200L流動相溶解,以14000r/m in 離心5m in,取上清液90L進樣。3結(jié)果與討論3.1樣品的HPLC/ES I2M S分析條件的優(yōu)化利多卡因在樣本處理過程中性質(zhì)穩(wěn)定,重現(xiàn)性好,保留時間及峰形良好,與曲美他嗪無干擾,實驗中選作內(nèi)標化合物。曲美他嗪為

8、弱堿性化合物,pH值對其分析過程有很大影響,經(jīng)反復實驗后采用pH 2.00的三氟乙酸水溶液與甲醇共同作為流動相,顯著增加了目標檢測物的離子化效率,并有效地改善峰形。為能夠使電噴霧質(zhì)譜儀得到穩(wěn)定的噴霧,儀器的霧化氣(N2壓力設為0.207MPa;毛細管電壓優(yōu)化為4.0kV,確保得到響應值高且穩(wěn)定的信號。圖1顯示的是曲美他嗪分子和利多卡因分子在裂解電壓優(yōu)化為70V時,全掃描模式(掃描質(zhì)核比范圍為50350m/z下得到的電子轟擊質(zhì)譜圖。其中曲美他嗪的碎片離子峰267(m/z的響應值最大,利多卡因的碎片離子峰235(m/z的響應值最大。因此,實驗選定267和235作為監(jiān)測離子進行專屬性掃描,可避免干擾

9、且提高目標檢測物的靈敏度。圖1曲美他嗪(a和利多卡因(b的質(zhì)譜Fig.1M ass s pectra of tri m etazidine(aand lidocaine(b裂解電壓(the frag ment voltage:70V,掃描質(zhì)量范圍(the mass range50350m/z。3.2樣品前處理方法的優(yōu)化本研究曾對液液萃取法和直接沉蛋白法進行比較。在考察液液萃取法時,選用乙醚、正己烷、環(huán)己烷和乙酸乙酯4種提取溶劑,對含曲美他嗪血樣進行萃取分離。由于曲美他嗪是弱堿性分子,當體系的pH為堿性時,曲美他嗪以分子形式存在,有利于提取回收。然而,有文獻報道在較高的pH條件下,曲美他嗪的血漿

10、蛋白結(jié)合率也較高8。研究中發(fā)現(xiàn),在所考察的4種提取溶劑中,即使是萃取效果最好的乙酸乙酯,提取回收率也只有50%左右。在考察直接沉淀蛋白法時,比較了甲醇和三氟乙酸兩種蛋白沉淀劑。其中,三氟乙酸作為蛋白沉淀劑用量較少,但需要使用其它的堿作為中和劑,且殘留于體系的中和劑常常會抑制質(zhì)譜離子化效率,降低檢測靈敏度;甲醇作為蛋白沉淀劑,可以有效沉淀絕大部分蛋白,同時輔以少量三氟乙酸調(diào)節(jié)pH值,可降低曲美他嗪與血漿蛋白的結(jié)合率,同時又不需使用堿來中和,結(jié)果使得提取回收率達到70%以上。經(jīng)比較后,選定甲醇輔以三氟乙酸沉淀蛋白作為樣品前處理方法。進一步優(yōu)化了甲醇、三氟乙酸溶液的配比,在甲醇與血漿比例為1.51、

11、21、2.51和31的條件下,分別加入20、30、40和50L三氟乙酸溶液(15,V/V的蛋白沉淀。結(jié)果表明:在甲醇與血漿比例為21的體系中,加入30L三氟乙酸溶液(15,V/V時提取回收率最高。245分析化學第35卷本實驗的樣品前處理方法能夠快速、有效地消除血漿中蛋白對系統(tǒng)的影響,減少因質(zhì)譜離子源和毛細管受到污染造成響應值大幅度降低的弊端,使色譜柱在分析過程中柱效穩(wěn)定,延長色譜柱使用壽命。3.3方法專屬性考察分別取空白血漿、均勻混合的400g/L 曲美他嗪溶液和1000g/L 內(nèi)標利多卡因溶液的血漿以及加入1000g/L 內(nèi)標利多卡因的健康受試者給藥8h 時收集的血漿樣品,依2.4方法操作,

12、得圖2。曲美他嗪的保留時間約為3.47m in,利多卡因的保留時間約為5.05m in 。結(jié)果表明,空白血漿中內(nèi)源性物圖2不同血漿樣品的選擇離子監(jiān)控模式的色譜圖Fig .2Chr omat ogra m s of tri m etazidine and ridocaine in p las ma at selected i on monit oring (SI M mode 1.空白血漿(blank p las ma ; 2.空白血漿+曲美他嗪(40g/L +利多卡因(100g/L (a s p iked p las ma sa mp lewith tri m etazidine (40g/L

13、 and lidocaine (100g/L ; 3.受試者服藥8h 后血漿(tested p las ma sa mp le;tri m etazidine at3.47m in,lidocaine at 5.05m in 。質(zhì)不干擾目標物的測定。3.4線性范圍和定量檢出限精確吸取500L 健康人空白血漿7份,分別加入50L 不同濃度的曲美他嗪工作液,配制成曲美他嗪濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0和100.0g/L 血漿樣品,依2.4方法操作。以曲美他嗪和內(nèi)標的峰面積比(Y 對曲美他嗪的濃度(X 進行線性回歸,回歸方程為Y =0.0028X -0.0015(r

14、 =0.9995,n =7,血漿中曲美他嗪濃度在2.5100g/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關系。在信噪比(S /N 為101的條件下,此法血漿中曲美他嗪的定量檢出限為2.5g /L 。3.5提取回收率將曲美他嗪質(zhì)控液加入空白血漿中,分別配制5.0、20.0和80.0g/L 3個濃度的質(zhì)控樣品,每個濃度5份,依2.4方法操作,記錄曲美他嗪的峰面積A 血漿;另取高、中、低3個濃度曲美他嗪質(zhì)控液,經(jīng)流動相稀釋4倍后直接進樣分析,每個濃度5份,記錄曲美他嗪的峰面積A 標品,則血漿中曲美他嗪提取回收率(%=A 血漿/A 標品×100%,結(jié)果見表1。表1血漿樣品中曲美他嗪的回收率與精密度(n =5T

15、able 1Recovery and p recisi on of tri m etazidine in p las ma (n =5標示濃度Sp iked concentrati on (g/L 提取回收率(平均值±標準差Extracti on recovery (Mean ±S D (%相對回收率(平均值±標準差Relative recovery (Mean ±S D (%相對標準差RS D (%日間I ntra 2day 日內(nèi)I nter 2day 5.072.25±2.17103.03±2.91 2.83 4.8320.074

16、.71±5.3396.35±5.88 6.10 5.8280.080.47±4.42102.94±3.44 3.34 5.77圖319名志愿者口服20mg 曲美他嗪后的平均血藥濃度2時間曲線Fig .3Hu man p las ma concentrati on 2ti m e p r ofileafter oral ad m inistrati on of tri m etazidine (20mg 3.6精密度和相對回收率將曲美他嗪質(zhì)控液加入空白血漿中,分別配制成低、中、高3個濃度(5.0、20.0和80.0g/L 的質(zhì)控樣品,依2.4方法操作,每個

17、濃度在同日內(nèi)連續(xù)測定5次,在連續(xù)3d 內(nèi)重復測定3次,且均與標準曲線同時進行,根據(jù)此時的標準曲線計算曲美他嗪實測濃度,并與標示濃度相比,采用單因素方差分析計算方法學精密度,用RS D表示,相對回收率用實測濃度平均值與標示濃度的比值百分數(shù)(%表示,結(jié)果表明(如表1:日間、日內(nèi)精密度及相對回收率均滿足生物樣品分析的要求。3.7方法應用19名健康男性志愿者分別口服鹽酸曲美他嗪片劑20mg,平均血藥濃度2時間曲線見圖3。志愿者分別在服藥前、服藥0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12和24h 取前臂靜脈345第4期焦陽等:高效液相色譜/電噴霧質(zhì)譜法測定血漿中曲美他嗪濃度445分析化學第35

18、卷血4mL,置肝素抗凝管內(nèi)、離心(4000r/m in,10m in分離出血漿,置-20冷凍保存?zhèn)溆?。?14方法處理血漿樣品,每個志愿者的全部血漿樣品在同一批測定,且每批生物樣品測定時建立新的標準曲線。同時,在各分析批次樣品中均勻隨機放置高、中、低3個濃度的質(zhì)控樣品,以此來監(jiān)控分析過程的有效性。References1A rgaud L,G o mez L,Gateau2Roesch O,Couture2Lepetit E,Louf ouat J,Robert D,Ovize M.J.M ol.Cell Cardiol.,2005, 39(6:8938992Kant or P F,Lucien

19、 A,K ozak R,Lopaschuk G D.C irc.Res.,2000,86(5:5805883JeoungM K,Ki m K S,Ki m C S,Ki m N H,Chung Y B,Hong J T,Moon D C.J.L iq.Chro m atogr.R.T,2005,28(9: 129913094Courte S,B r o met N.J.Chro m atogr.,1981,224(1:1621675Fay L,M ichel G,G oup it P,Har pey C,Pr ostM.J.Chro m atogr.,1989,490(1:1982056de

20、Jager A D,Sutherland F C W,BadenhorstD,Hundt H K L,S wart K J,Scanes T,HundtA F.J.L iq.Chro m atogr.R.T, 2001,24(14:212121327Medvedovici A,A lbu F,Georgita C,David V.B io m ed.Chro m atogr.,2005,19(7:5495558Morin D,Sapena R,Eli m adi A,Labidalle S,Le R idant A,Tille ment J P.B r.J.Phar m acol.,2000,

21、130(3:655663D eter m i n a ti on of Tr i m et az i d i n e i n Hu man Pl a s ma by H i ghPerfor mance L i qu i d Chro ma tography2M a ss Spectro m etryJ iao Yang1,Su M ing2M ing1,Chen M in2Jun31,J ia W ei1,Tao Ping2,Q iu Yi2Qun3,Huang Zhong2Yi31(School of Phar m acy,Shanghai J iaotong U niversity,Sh

22、anghai2000302(Instrum ental A nalysis Center of Shanghai J iaotong U niversity,Shanghai2000303(Shanghai J ingan Hospital,Shanghai200040AbstractA sensitive and s pecific high perf or mance liquid chr o mat ography/electr os p ray i onizati on2mass s pec2 tr o metry(HP LC/ESI2MSmethod has been devel o

23、ped and validated f or the identificati on and quantificati on of tri m etazidine(T MZin hu man p las ma.The T MZ and internal standard,lidocaine,were is olated fr o m p las ma by p r otein p reci p itati on with methanol.The acidified supernatant was dried in a r otati onal2vacuu m2concentrat or, and the residue was diss olved with mobile phase p ri or t o analysis.Chr o mat ographic separati on was perf or med on a Xterra MS C18colu mn(150mm×4.6mm,with5m particle sizewith the mobile phase consisting of metha2 nol and water(pH=2.0adjusted with triflu