染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與基因表達調(diào)控

1、真核細胞中 DNA 與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色質(zhì)和染色體是生物進化的必然結(jié)果1。核小體 (Nucleosome) 是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，其為長度約 160bp 的 DNA 繞由 H2A, H2B, H3 和 H4 各兩分子形成的八聚 體約兩圈的粒狀結(jié)構(gòu)，其中H3和H4各兩分子形成的四聚體位于八聚體的中間，其兩端均與H2A和H2B各一分子形成的二聚體 結(jié)合。第五種組蛋白H1或稱H5與連接兩核小體之間的DNA結(jié)合，并與相鄰兩核小體首尾相聯(lián)，以穩(wěn)定核心組蛋白與 DNA雙鏈的結(jié)合。 Crane 等(1997) 對 H1 與核小體的結(jié)合位置提出新的看法 2, 認為染色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)是以核小體為基本結(jié)構(gòu)單位的

2、一級結(jié)構(gòu)經(jīng)過進一步的盤繞、 折疊而形成。由于染色質(zhì)是真核細胞遺傳信息的載體 , 真核基因的表達調(diào)控一定與染色質(zhì)密切相關。 研究染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其在基因表達調(diào)控中的作用 , 對于揭示真核生物基因表達調(diào)控的機理有重要意義。1 轉(zhuǎn)錄區(qū)染色質(zhì)對 DNaseI 的敏感性增加真核生物的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)在不同物種間無顯著差異 , 核小體的體積也基本恒定 , 但核小體間連接 DNA 的長度是可變的 , 它在 不同的物種中，以及不同的組織，有時不同的發(fā)育階段均有可能不同。例如，菜豆(Phaseolus vulgaris)的子葉和葉片組織中，染色質(zhì)核小體的重復長度有差異 , 葉片中為 191bp, 而子葉中縮短到 177

3、bp, 但沒有發(fā)現(xiàn)這種差異與基因的特異表達有關 3。 Murray和kennard的進一步研究卻發(fā)現(xiàn)，菜豆子葉特異表達的基因-菜豆蛋白基因(phaseolin)的染色質(zhì)區(qū)對DNase I的敏感性比 葉片中強，說明染色質(zhì)對DNase I敏感與基因的轉(zhuǎn)錄有關。在豌豆 (Pisum sativum)中，Steinmuller等(1986)4研究了另一儲 藏蛋白-豆球蛋白(Legumin)基因的染色質(zhì)在子葉和葉片中變化。在子葉中靠近豆球蛋白基因3'端的染色質(zhì)對DNase I的敏感度比葉片中高 5倍。大麥(Hordeum vulgare)中，大麥醇溶蛋白(Hordein)基因，捕光葉綠素a/b蛋

4、白(light harvesting chlorophyll a/b protein, LHCP)基因和1516 kD多肽基因的染色質(zhì)對 DNase I的敏感度也隨著這些基因的表達而顯著的增加4。在動物組織細胞中的研究同樣顯示，基因的轉(zhuǎn)錄伴隨著其染色質(zhì)對 DNase I的敏感性顯著增加。母雞中，球蛋白基因在網(wǎng)織 紅細胞中表達，而卵清蛋白基因則于輸卵管中有轉(zhuǎn)錄；研究發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)織紅細胞中編碼球蛋白mRNA的染色質(zhì)DNA更易被DNaseI降解，輸卵管細胞中卵清蛋白基因區(qū)域的染色質(zhì)比球蛋白基因區(qū)對DNase I更敏感5, 6。關于染色質(zhì)對DNase I敏感與該區(qū)基因被轉(zhuǎn)錄的關系，研究者認為，基因的轉(zhuǎn)錄造

5、成染色質(zhì)易被 DNase I消化，而非前者是 后者的原因。2染色質(zhì)中DNase I超敏感點與基因的表達調(diào)控有關與由于基因的轉(zhuǎn)錄而使轉(zhuǎn)錄區(qū)染色質(zhì)對DNaseI的敏感性增加不同，染色質(zhì)中還存在一些短的區(qū)段,一般為50200bp之間，對DNase I消化更敏感，稱DNase I超敏感點(DNase I Hypersensivity sites DH sites), 為無核小體區(qū)7。直接的證據(jù)來 自 Choder 等的實驗結(jié)果 ， 他們用電鏡觀察 SV40 微小染色體時發(fā)現(xiàn)其中存在無核小體區(qū)段 ， 該區(qū)段與限制內(nèi)切酶分析定位的超 敏感點在同一位置。經(jīng)過對很多基因染色質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)超敏感點是廣泛存在的，

6、一般位于基因的5'端啟動子之內(nèi)或啟動子的周圍。玉米中有兩個基因位點(Adh1和Adh2)編碼乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase),它們均受厭氧協(xié)迫而表達。Paul等(1987)8發(fā)現(xiàn)，Adh1的5'端區(qū)域存在兩種類型的 DNase I超敏感點，即組成型和誘導型。前者位于基因更上游位置，大約為-160 170之間，經(jīng)厭氧誘導后，出現(xiàn)兩個新的DNase I超敏感點，主要者中心位于-40,次要者中心位于-140,兩者之間為厭氧反應域 (an aerobic respo nse regio ns),其中至少有兩個順序，-30位的TATAA和-90位的CAAT,被認為

7、對基因的調(diào)控非常重要。厭氧環(huán)境除了誘導產(chǎn)生兩個超敏感點以外，還使組成型DNase I超敏感點區(qū)域的范圍擴大。玉米 Adh2 基因 5'端存在三個超敏感點均為組成型的， 它們的中心位置分別為 -55， -305， 和-455， 當該基因受誘導而表達時，超敏感點的敏感度增加，并且靠近TATAA序列的超敏感點(即-55位)向3'端方向延伸,使TATAA框暴露。存在于基因調(diào)控區(qū)(包括啟動子和增強子)的DNase I超敏感點(組成型或經(jīng)誘導產(chǎn)生)對基因的表達是必要的。在人類B球蛋 白基因的5'端的上游，大約1020kb位置，存在著位點控制區(qū)(Local control regio

8、ns, LCRs)或稱位點激活區(qū) (Local activating regio ns, LARS),它可以使其下游的基因的表達不受其所在染色體位置的影響。LCRs中存在4個超敏感點，如果LCRs與人類B球蛋白基因 (包括啟動子和其他一些順式調(diào)控元件)一起轉(zhuǎn)化小鼠 ， 則球蛋白 mRNA 在轉(zhuǎn)化小鼠的合成量與整合的基因的拷貝數(shù)成正相關，與其整合的位置無關。但如果其中LCRs的兩個超敏感點(即5'-SH和HS-3')沒有被整合，則球蛋白的表達量很少，LCRs 失去了其原有的功能 9。3 染色質(zhì)無核小體區(qū)形成的機理在染色質(zhì)的DNase I超敏感點內(nèi)沒有完整的核小體結(jié)構(gòu)形成。體外實驗

9、表明，雖然基因編碼區(qū)的核小體對基因的轉(zhuǎn)錄影響較小, 但核心啟動子區(qū)形成核小體后 , 轉(zhuǎn)錄將無法起始 10?；虻霓D(zhuǎn)錄要求其核心啟動子區(qū)和上游調(diào)控原件(Core promoterand upstream regulatory elements) 為無核小體區(qū)或該區(qū)核小體被去除 (Displacement) 。研究基因自然狀態(tài)下及基因轉(zhuǎn)錄狀態(tài)下 染色質(zhì)的結(jié)構(gòu) , 發(fā)現(xiàn)真核細胞無核小體區(qū)的形成至少采取兩種策略 : 核小體的持久型去除 (Persistant displacement) 和誘導去除 (Induced displacement) 11 。持久型去除主要指在啟動子元件 (Promoter

10、element) 區(qū)自然狀態(tài)下不形成核小體 , 它們主要存在于組成型轉(zhuǎn)錄的啟動子中 , 某些誘導表達的基因在被誘導轉(zhuǎn)錄前其啟動子中也發(fā)現(xiàn)這種類型的無核小體區(qū)。持久型無核小體區(qū)的形成可能涉及組成型因子的作用。在 DNA 復制過程中 , 核小體未裝配之前可以出現(xiàn)短暫的無核小體染 色質(zhì)區(qū) , 有些組成型因子優(yōu)先與該區(qū) DNA 結(jié)合, 并阻礙隨后該區(qū)核小體的形成。在果蠅熱休克基因中 , 通用轉(zhuǎn)錄因子 (General factors)和GAGA因子(CT因子)很可能參與了核心啟動子區(qū)(即TATA盒和轉(zhuǎn)錄起始點)持久型無核小體區(qū)的形成，并使上游調(diào)控元 件維持對熱擊因子的易接近性12。SP1因子也可能參與

11、持久型無核小體區(qū)的形成。很多"管家基因(Housekeeping genes)"均含有多個 SP1 結(jié)合位點。 SP1 與這些位點結(jié)合后 , 阻礙了組蛋白 H1 的結(jié)合。 在酵母 (S. cerevisiae) 中，有一類組成型表達的蛋白 質(zhì), 稱為通用調(diào)節(jié)因子 (General regulatory factors, GRFs), 它們在酵母細胞中的含量特別豐富 , 每一種均與特定序列的 DNA 結(jié) 合，并使該區(qū)為無核小體區(qū)。當 GRF結(jié)合點突變后，研究發(fā)現(xiàn) GRF與其結(jié)合點的結(jié)合為該無核小體區(qū)的形成所必需，并對相鄰區(qū)域核小體的形成產(chǎn)生重要影響。在his4基因的HSE區(qū)有

12、RAP1(GRF中的一種)的結(jié)合位點，RAP1與其結(jié)合位點結(jié)合后產(chǎn)生無核小體區(qū)，該無核小體區(qū)為誘導因子 GCN4和BAS1與BAS2等基本因子(basal facto在該區(qū)起作用時所必需13。誘導去除是指基因在表達前其上游因子結(jié)合位點(Upstream factors-binding sites)以及核心啟動子區(qū)均形成核小體，經(jīng)誘導后， 調(diào)節(jié)因子直接或間接地引起核小體的去除。pho5 基因在酵母中編碼酸性磷酸酶 ， 當酵母生長的培養(yǎng)基中磷酸缺乏時 ， 該基因被誘導而表達。 pho5 啟動子區(qū)在抑制狀態(tài) 下形成6個核小體，在倒數(shù)第二個核小體上(從轉(zhuǎn)錄起始點算起)有PHO4和PHO2兩個反式作用蛋

13、白的結(jié)合位點，第一個結(jié)合位 點位于TATA框在倒數(shù)第一個核小體上,PHO4的另一結(jié)合點位于倒數(shù)第二和第三個核小體間的連接DNA上14。突變分析發(fā)現(xiàn)，PHO4和PHO2兩蛋白為產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)和pho5基因表達所必需，在磷酸缺乏時，PHO4蛋白先與連接DNA的靶位點結(jié)合,在PHO2的協(xié)同作用下，引起第二位核小體的解體，暴露PHO4的第二個結(jié)合點。Svaren(1997)等15的研究還表 明，PHO4與其結(jié)合位點結(jié)合后，其他蛋白復合體又與 PHO4蛋白結(jié)合，使該區(qū)的染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變。后結(jié)合上的蛋白復合體具 有 ATP 酶的活性 ， 說明染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變是一個耗能的過程。 PHO4 的功能同

14、時還受 pho80 和 pho85 兩個基因產(chǎn)物的調(diào)控 ， PHO80和PHO85兩蛋白組成激酶復合體,對PHO4蛋白進行磷酸化使其激活功能被抑制16。PHO5的表達需要倒數(shù)前四個 核小體的解體?，F(xiàn)在還不知道其他三個核小體被替代的具體方式 ， 但能量平衡是一個重要原因 ， 第二個核小體上 DNA 序列的變 化， 將使啟動子的誘導和核小體解體更容易。與pho5基因相似，鼠乳腺瘤病毒(mouse mammary tumor virus MMTV)長末端重復(Iong terminal repeat LTR) 順序的啟動子受糖皮質(zhì)激素受體 (glucocorticoid receptor GR) 的

15、調(diào)控。該啟動子也形成 6 個位置恒定的核小體，在倒數(shù)第二個核小體表面有 四個糖皮質(zhì)激素受體的識別位點，分別位于-175,-119,-98和-83,其中-175和-83兩結(jié)合位點DNA的主溝面對溶液，可以與GR 結(jié)合，這兩個位點相距92bp。由于核小體的形成，這兩個位點正好位于同一核小體的同一側(cè)，有利于GR的結(jié)合和后來的激活過程。另兩位點其主溝面對組蛋白，因受空間的阻礙與GR沒有結(jié)合能力17。在被誘導條件下，GR以二聚體形式與核小體上的識別位點結(jié)合，但似乎并沒有使其結(jié)合區(qū)核心組蛋白被去除，而是形成了 GR-核小體復合體。體內(nèi)研究表明，具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動子幾乎無例外的為 DNaseI 超敏感區(qū) ，

16、 指示它們?nèi)狈φ５暮诵◇w結(jié)構(gòu)。 GR 結(jié)合后可能促進其他蛋白復合體 (其中包括 SWI1、2、3 蛋白在哺乳動物中的類似物 )與核心組蛋白作用 ， 引起核小體的解體 18。 SWI1、2、3 是酵母基因編碼的蛋白質(zhì) ， 為GAL1和GAL10等基因的轉(zhuǎn)錄以及酵母 GAL4蛋白起作用時所必需，它們可能與另兩種蛋白 SNF5和SNF6形成多亞基復合體, 輔佐基因?qū)Ｒ恍缘鞍灼鹱饔?9。由GR誘導的轉(zhuǎn)錄是短暫的，幾個小時以后，基本轉(zhuǎn)錄復合體,NF1, GR和八聚體因子又被核 心組蛋白替代 ， 它們的結(jié)合位點又形成核小體 ， 啟動子轉(zhuǎn)錄功能被抑制。轉(zhuǎn)錄因子被替代的機理還不清楚 ，組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子與 啟

17、動子區(qū)的結(jié)合很可能是一個動態(tài)過程。Wong等20對甲狀腺激素 B受體的突變研究發(fā)現(xiàn)，該激素受體與甲狀腺結(jié)合后，可以引起其靶位點染色質(zhì)的解體和調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄起始 ， 但這兩個過程分別與激素受體的不同功能區(qū)有關， 染色質(zhì)的解體不足以引起基因的轉(zhuǎn)錄起始。4 組蛋白與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關核心組蛋白明顯分為兩個區(qū)域 羧基末端的疏水區(qū)和氨基末端的親水區(qū) , 羧基端形成球形結(jié)構(gòu)參與核小體核心的形成 , 氨基端帶正電荷位于核小體的外部 , 與周圍環(huán)境作用 , 為基因的表達調(diào)控所必需 , 并且不同核心組蛋白的氨基末端所起作用不 同。Kayne等(1988) 21丨發(fā)現(xiàn)，H4的N-末端的缺失可以解除酵母沉默交配位點(

18、silent mating loci)HML和HMRa的抑制作用，使鄰近酵母B2啟動子位置的核小體解體。H4末端的4個帶正電荷氨基酸殘基(Lys16, Arg17, His18或Arg19)的其中之一被 甘氨酸替代，均可以使交配頻律降低 5 000倍22。H3和H4的氨基末端對酵母端粒區(qū)沉默也有重要作用，它們N-末端的缺失或一些氨基酸的替代均可以解除端粒沉默(telomeric silencing)。H3和H4的N-末端對GAL1啟動子也有重要的調(diào)節(jié)功能，但它們所起的作用并不相同。H4組蛋白N-末端第423位氨基酸的缺失或該區(qū)段乙酰化位點的半胱氨酸殘基(即第5、8、12和16位)被其他氨基酸替

19、代,將大大降低GAL1啟動子的活性；與此相反，H3組蛋白N-末端415位氨基酸區(qū)段的缺失以及位于該區(qū)或 鄰近區(qū)域的半胱氨酸殘基(即第9、14、18和23 位)的替代，可以使GAL1啟動子活性增加。Fisher-Adams等(1995) 23在H3 和H4 N-末端缺失對GAL1啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響方面進行了很精細的研究，也得到相似的結(jié)論。組蛋白N-末端乙酰化對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達調(diào)控有重要影響。Allfery等(1964) 24認為，染色質(zhì)組蛋白N-末端半胱氨酸殘基的乙?；?，可以作為該染色質(zhì)具有轉(zhuǎn)錄活性的標志。組蛋白乙?；瘻p弱了染色質(zhì)對DNA 的限制， 使核小體的構(gòu)象發(fā)生變化， 轉(zhuǎn)錄因子接近核

20、小體的機會增加，因而對基因的轉(zhuǎn)錄是有利的。當組蛋白的乙酰化去除后， 伴隨著轉(zhuǎn)錄的關閉 ， 同時，組蛋白的乙酰化程度又決定于乙?；负腿ヒ阴；傅钠胶猓虼?Wolffe(1996)認為25,對某一特定的基因而言，其染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄與否決定于乙?；负腿ヒ阴；傅谋壤?。目前 ， 在多種生物中 ， 乙酰轉(zhuǎn)移酶基因和去乙?；富蚓驯豢?隆。P/CAF為人類中被克隆的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，研究表明，P/CAF基因產(chǎn)物與已知的轉(zhuǎn)錄共激活子 (coactivator)CBP和p300結(jié)合,后者與轉(zhuǎn)錄因子(例如 CREB, c-JUN和FOS)結(jié)合，因此，Sternglanz(1996)等26認為，乙酰

21、轉(zhuǎn)移酶通過與轉(zhuǎn)錄因子和共激活 子結(jié)合， 催化啟動子區(qū)核心組蛋白的乙?；?。5 核小體與基因調(diào)控核小體是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位。體內(nèi)外實驗均證實 ， 核小體為基因轉(zhuǎn)錄的一個通用抑制子 (general repressor) 。由于缺少 H4組蛋白，核小體不能形成的酵母細胞系中，很多基因變?yōu)榻M成型表達，而在正常的細胞株系中，它們均處于抑制狀態(tài)。但大量的實驗結(jié)果證明，核小體的形成和在染色質(zhì)的精確定位為真核基因的表達所必需27。在MMTVLTR啟動子中，兩個 GR 結(jié)合位點 (第-175 和-83)相距 92bp， 由于核小體的形成 ， 它們正好位于核小體的同一側(cè)面 ， 在空間上非常接近 ， 這顯然有 利于GR的結(jié)合，因而對基因的誘導表達有利。果蠅hsp26啟動子中，第-51位和第-34位為熱休克轉(zhuǎn)錄因子(heat sh