幾丁質(zhì)、 殼聚糖及其降解產(chǎn)物對巨噬細(xì)胞的作用

1、幾丁質(zhì)、 殼聚糖及其降解產(chǎn)物對巨噬細(xì)胞的作用                          作者：麻攀, 譚成玉, 白雪芳, 杜昱光 【摘要】  巨噬細(xì)胞是最重要的免疫細(xì)胞之一, 它既是免疫細(xì)胞, 又是輔佐免疫應(yīng)答細(xì)胞, 它參與所有免疫效應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)生、 動(dòng)員、 活化和調(diào)節(jié)。本文中介紹了幾丁質(zhì)、 殼聚糖及其降解產(chǎn)物等對巨噬細(xì)胞

2、的作用, 以及它們的應(yīng)用。 【關(guān)鍵詞】  幾丁質(zhì); 殼聚糖; 殼寡糖; 巨噬細(xì)胞; 細(xì)胞因子; 一氧化氮    幾丁質(zhì)是N乙酰葡糖胺（NAGA）經(jīng)1, 4糖苷鍵連接的線性同源多聚體, 它廣泛存在于昆蟲、 甲殼類動(dòng)物外殼及真菌、 酵母細(xì)胞壁及一些藻類中。殼聚糖是幾丁質(zhì)部分脫乙酰產(chǎn)物。很多實(shí)驗(yàn)證明幾丁質(zhì)和殼聚糖在提高免疫力、 抗腫瘤、 防治病原微生物等方面都有較明顯作用, 現(xiàn)在人們又逐漸開始對其降解物幾丁寡糖、 殼寡糖產(chǎn)生了興趣。通過輻射法、 化學(xué)法或酶降解法等各種措施將幾丁聚糖和殼聚糖水解即可得到幾丁寡糖和殼寡糖。巨噬細(xì)胞廣泛分布于機(jī)體的每個(gè)器官中, 在先

3、天性免疫和獲得性免疫都扮演著重要角色。它可以直接殺傷病原體; 同時(shí), 它還具有免疫調(diào)節(jié)功能, 與其他免疫細(xì)胞一起維持機(jī)體平衡與穩(wěn)定, 是機(jī)體內(nèi)最重要的免疫細(xì)胞之一。這里就對幾丁質(zhì)、 殼聚糖及其降解產(chǎn)物對巨噬細(xì)胞的作用作以綜述。    1  對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響    Porporatto等1研究了殼聚糖對靜息的和炎癥激活的巨噬細(xì)胞中的精氨酸代謝途徑的效應(yīng)。他們認(rèn)為在靜息的巨噬細(xì)胞中, 低相對分子質(zhì)量（Mr）的殼聚糖可適當(dāng)激活并誘導(dǎo)的一氧化氮合成酶以及精氨酸代謝途徑; 在炎癥激活的巨噬細(xì)胞中, 通過殼聚糖的處理, 精氨酸酶

4、活性顯著提高。用殼聚糖刺激的巨噬細(xì)胞的上清液能顯著提高小鼠細(xì)胞系C6的增殖。從而說明了殼聚糖的愈傷活性可能是依賴于在傷處的炎癥環(huán)境中增強(qiáng)的精氨酸酶活性。Jeong等2對高M(jìn)r水溶性殼聚糖WSC（watersoluble chitosan, Mr平均在300 000, 去乙?；潭仍?0%以上）在RAW264.7巨噬細(xì)胞一氧化氮的產(chǎn)生方面做了研究, 認(rèn)為盡管以前證明了水不溶性的殼聚糖單獨(dú)在體外對巨噬細(xì)胞一氧化氮產(chǎn)生有刺激作用, 然而, WSC單獨(dú)卻沒有此作用。當(dāng)WSC與重組的干擾素（rIFN）聯(lián)合作用時(shí), 則對一氧化氮的合成有明顯的協(xié)作誘導(dǎo)效應(yīng), 并且有劑量依賴關(guān)系。用rIFN處理后24 h再加

5、入WSC對刺激一氧化氮合成效果最好。他們還指出, rIFN和WSC的協(xié)作主要是依賴于WSC誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF和NFB的激活。Hwang等3探討了幾丁質(zhì)及其衍生物對激活的RAW264.7巨噬細(xì)胞一氧化氮的產(chǎn)生的作用。他們發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)及其衍生物對于激活的RAW264.7巨噬細(xì)胞一氧化氮的產(chǎn)生有明顯的抑制作用。6N乙酰殼六糖和五N乙酰殼五糖也能抑制NO的產(chǎn)生, 但沒有幾丁質(zhì)及其衍生物那么明顯。而N乙酰殼四糖、 三糖、 二糖以及幾丁質(zhì)的單體, N乙酰葡糖胺和葡糖胺對于激活的巨噬細(xì)胞一氧化氮產(chǎn)生卻沒有明顯的作用。表明了幾丁質(zhì)物質(zhì)在愈傷方面的作用可能與抑制了激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮有關(guān)。Yu等4在研究中指出

6、, 殼寡糖能明顯提高巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）活性, 并誘導(dǎo)一氧化氮和TNF的產(chǎn)生。另外, 他們發(fā)現(xiàn)殼寡糖能提高核提取物中NFB的蛋白水平。當(dāng)用特異性抑制劑阻斷NFB時(shí)則會(huì)造成NO和TNF的減少。從而推測NFB在殼寡糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO和TNF起到重要作用。Wu等5從殼聚糖的水解物中分離得到一種Mr 20 000的低分子量殼聚糖和殼寡糖混合物。然后進(jìn)一步探討了該殼聚糖水解物、 低分子量殼聚糖和殼寡糖混合物對RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO、 NFB的激活以及誘導(dǎo)型的一氧化氮合成酶的基因表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)這3種物質(zhì)單獨(dú)都不會(huì)影響RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO, 而當(dāng)殼聚糖水解物/

7、殼寡糖混合物與IFN聯(lián)合作用時(shí)則會(huì)明顯誘導(dǎo)NO的生成, 并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。而低Mr殼聚糖和IFN聯(lián)合作用卻抑制了NO的產(chǎn)生。他們認(rèn)為殼聚糖水解物與殼寡糖混合物是促進(jìn)了NFB遷入核內(nèi)加強(qiáng)了其與DNA的結(jié)合活性, 從而促進(jìn)了iNOS基因的表達(dá)而增強(qiáng)了NO的生成。Seo等6研究了水溶性殼聚糖低聚物（WSCO）對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO合成以及巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的對小鼠MethA纖維肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性的作用。WSCO本身對NO合成和殺傷腫瘤細(xì)胞沒有作用, 但當(dāng)用WSCO和IFN共同處理巨噬細(xì)胞時(shí), 它們可以協(xié)同作用而提高一氧化氮的合成并促進(jìn)對腫瘤細(xì)胞的殺傷。而這種協(xié)同作用主要是依賴于WSCO促進(jìn)了腫瘤壞死因子

8、的分泌。    2  對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的影響    柯海萍等7將殼寡糖作用于體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞, 運(yùn)用RTPCR和ELISA技術(shù), 發(fā)現(xiàn)殼寡糖能促進(jìn)IL18基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯。Feng等8在研究中發(fā)現(xiàn), 殼寡糖能刺激體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞釋放TNF和IL1。Han等9通過RTPCR測定TNF的轉(zhuǎn)錄水平來檢測指出甘露糖受體可能是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吸收殼寡糖的受體。吳海明等10在實(shí)驗(yàn)中提出殼寡糖能促進(jìn)巨噬細(xì)胞因子IL1、 TNF和IL18基因的表達(dá), 而這些細(xì)胞因子又可以反饋激活巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞, 形成狀的反饋調(diào)節(jié)關(guān)系, 從而

9、極大地增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能和抗腫瘤能力。Chou等11探究了殼聚糖對脂多糖處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞的環(huán)氧化酶途徑以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生的作用。他們指出殼聚糖明顯抑制了PGE2的過量產(chǎn)生以及COX2蛋白的表達(dá)和活性, 同時(shí)一些促炎癥因子, 如TNF和IL1的形成也被抑制, 但卻加強(qiáng)了抗炎癥因子IL10的形成。因此, 殼聚糖促進(jìn)了傷口的愈合。Bianco等12指出從真菌細(xì)胞中提取的殼聚糖能夠激活巨噬細(xì)胞且加強(qiáng)花生四烯酸的遷移, 并呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。Fatiha等13認(rèn)為殼聚糖可以作為一種基因輸送物質(zhì), 他們對殼聚糖DNA納米分子與THP1巨噬細(xì)胞的相互作用進(jìn)行了探討。在高量的納米分子存在下仍然

10、檢測不到有TNF、 IL1、 IL6和IL10的分泌, 但在處理24 h和48 h后在細(xì)胞上清液中金屬蛋白酶9（MMP9）的分泌卻明顯提高了。因此, 他們認(rèn)為, 殼聚糖DNA納米分子與THP1巨噬細(xì)胞相互作用不能誘導(dǎo)促炎癥因子的釋放?；钚訫MP9在巨噬細(xì)胞中的出現(xiàn)可能是與納米分子的吞噬作用和降解而不是炎癥反應(yīng)有關(guān)。1             3  對巨噬細(xì)胞糖受體的研究    Wu等5通過用抗CD14, 抗TLR4和抗CR3抗體處理RAW264.

11、7巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)可以明顯阻斷殼聚糖水解物/殼寡糖混合物與IFN聯(lián)合作用對一氧化氮的促生成作用。提示殼寡糖混合物殼聚糖水解物中主要的功能組分, 與IFN協(xié)同刺激誘導(dǎo)NFB激活以及NO產(chǎn)生的作用是通過與RAW264.7巨噬細(xì)胞上CD14, TLR4和CR3受體結(jié)合而介導(dǎo)的。Feng等8通過激光共聚焦顯示, 甘露糖能抑制巨噬細(xì)胞通過特異性受體介導(dǎo)的殼寡糖的內(nèi)吞, 而脂多糖和葡聚糖則無此現(xiàn)象。他們還指出甘露糖BSA, 海藻糖BSA, 和N乙酰葡糖胺BSA是因?yàn)榕c殼寡糖競爭巨噬細(xì)胞上的帶有甘露糖特異性的凝集素受體而抑制巨噬細(xì)胞對其的內(nèi)吞。    4  在其他方面對巨

12、噬細(xì)胞的影響及應(yīng)用    龔燕鋒等14證明, 殼聚糖可以作為免疫佐劑提高對機(jī)體的免疫保護(hù)作用。Okamoto等15在研究中說明, 幾丁質(zhì)和殼聚糖的低聚物（NACOS和COS）能明顯增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的遷移活性, 但多聚物, 幾丁質(zhì)和殼聚糖以及殼聚糖單體（GlcN）卻沒有。他們還通過研究小鼠巨噬細(xì)胞系（rMp）指出, 多聚物, NACOS和GlcN能明顯增強(qiáng)rMp的遷移活性。Mori等16在研究中指出殼聚糖能夠誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞凋亡, 但是幾丁質(zhì)和可溶性低分子量殼聚糖卻沒有這個(gè)作用, 并且這種凋亡作用是通過Fas信號(hào)途徑介導(dǎo)的。殼聚糖處理能夠誘導(dǎo)如MHCI,

13、0; II,  Fc受體（FcRs）,  鐵傳遞蛋白受體, 甘露糖受體, Fas, 以及巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)2等激活標(biāo)記表達(dá), 而幾丁質(zhì)和低分子量可溶性殼聚糖只能誘導(dǎo)MHCI,  II分子的表達(dá), 從而說明殼聚糖可能是通過激活巨噬細(xì)胞來加速傷口愈合。曹秀明等17的實(shí)驗(yàn)表明殼寡糖在體外對HepG2、 BGC7901、 LS174這幾株腫瘤細(xì)胞的生長沒有明顯的抑制作用, 說明殼寡糖沒有細(xì)胞毒作用。同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了殼寡糖對小鼠S180實(shí)體瘤有顯著的抑制作用。另外, 他們指出殼寡糖能夠提高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù), 說明殼寡糖對胸腺、 脾臟有較強(qiáng)的保護(hù)作用, 體

14、外實(shí)驗(yàn)中殼寡糖還能提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力, 由此, 他們推斷殼寡糖具有抗腫瘤細(xì)胞生長的作用, 其機(jī)制可能是殼寡糖對機(jī)體免疫力有保護(hù)和調(diào)節(jié)作用, 而不是直接對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。Reese等18指出, 幾丁質(zhì)能夠誘導(dǎo)表達(dá)IL4的天然免疫細(xì)胞, 如嗜曙紅細(xì)胞、 嗜堿細(xì)胞等在組織中的累積, 從而在過敏性反應(yīng)以及寄生蟲免疫中起到防御作用, 并且脊椎動(dòng)物幾丁質(zhì)酶可以負(fù)面調(diào)控這種作用。Tanaka等19通過給小鼠口服和注射幾丁質(zhì)和殼聚糖對幾丁質(zhì)和殼聚糖的毒性進(jìn)行了研究。他們指出每兩周給小鼠腹膜內(nèi)注射5 mg幾丁質(zhì)1次, 注射12周以上, 小鼠表觀正常, 但在腸系膜中發(fā)現(xiàn)許多增生的巨噬細(xì)胞, 并且在脾臟中觀察到大量多形核細(xì)胞。皮下注射5 mg幾丁質(zhì)也可觀察到多形核細(xì)胞, 但沒有發(fā)現(xiàn)其他變化。當(dāng)腹膜內(nèi)注射5 mg殼聚糖時(shí), 小鼠的質(zhì)量明顯減少, 在第15周時(shí)此現(xiàn)象消失。用免疫組化的方法在腸系膜上觀察到有很多增生的巨噬細(xì)胞。皮下注射5 mg殼聚糖沒有引起動(dòng)物體以及細(xì)胞的異常。口服5 mg殼聚糖導(dǎo)致了小鼠體質(zhì)量下降, 同時(shí)也造成了小鼠腸道正常菌群中雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量的降低。提示幾丁質(zhì)和殼聚糖在長期的臨床使用上應(yīng)該慎重對待。    5  結(jié)語 &