在體生物光學成像技術(shù)的研究進展

1、第XX卷第X期自動化學報Vol.XX,No.X 200X年X月ACTA AUTOMATICA SINICA Month,200X在體生物光學成像技術(shù)的研究進展李慧1,2戴汝為2摘要在體生物發(fā)光成像和在體熒光成像是近年來新興的在體生物光學成像技術(shù),能夠無損實時動態(tài)監(jiān)測被標記細胞在活體小動物體內(nèi)的活動及反應,在腫瘤檢測、基因表達、蛋白質(zhì)分子檢測、藥物受體定位、藥物篩選和藥物療效評價等方面具有很大的應用潛力.本文詳細介紹了在體生物發(fā)光成像和在體熒光成像的特點、系統(tǒng)及應用,比較了它們的異同,綜述了在體生物光學成像技術(shù)的基本原理和應用領(lǐng)域,討論了將其應用于臨床的進一步發(fā)展方向.關(guān)鍵詞在體生物光學成像,生

2、物發(fā)光成像,熒光成像中圖分類號R319Development of In Vivo Optical ImagingLI Hui1,2DAI Ru-Wei2Abstract With the emergence of in vivo optical imaging,bioluminescence imaging anduorescence imaging can be used to non-invasively monitor the activities and response of cells marked with optical signals in real time,which

3、are considered to be promising tools for tumor detection,gene expression proling,protein molecular detection,drug receptor localization,drug screening and therapeutic evaluation.In this paper,the features,imaging systems and applications of in vivo bioluminescence imaging and in vivouorescence imagi

4、ng have been compared and introduced in detail.The basic theories,applicationelds and development in future of in vivo optical imaging are especially reviewed.Key words In vivo optical imaging,bioluminescence imaging,uorescence imaging隨著熒光標記技術(shù)和光學成像技術(shù)的發(fā)展,在體生物光學成像(In vivo optical imaging已經(jīng)發(fā)展為一項嶄新的分子、基

5、因表達的分析檢測技術(shù),在生命科學、醫(yī)學研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域得到廣泛應用,主要分為在體生物發(fā)光成像(Bioluminescence imaging和在體熒光成像(Fluorescence imaging兩種成像方式12.在體生物發(fā)光成像采用熒光素酶(Luciferase基因標記細胞或DNA,在體熒光成像則采用熒光報告基團(GFP、RFP等進行標記3.利用靈敏的光學檢測儀器,如電荷耦合攝像機(Charge coupled device camera,CCD camera,觀測活體動物體內(nèi)疾病的發(fā)生發(fā)展、腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、基因的表達及反應等生物學過程,從而監(jiān)測活體生物體內(nèi)的細胞活動和基因行為48.收

6、稿日期2007-08-08收修改稿日期2007-11-09Received August8,2007;in revised form November9,2007國家自然科學基金(30500131,北京市優(yōu)秀人才資助項目(20061D0501600216,中國博士后科學基金(20070410146和中國科學院王寬誠博士后工作獎勵基金資助資助Supported by National Natural Science Foundation of China(30500131,Beijing Distinguished Specialists Grant (20061D0501600216,Chin

7、a Postdoctoral Science Foundation (20070410146and Chinese Academy of Sciences K.C.Wong Postdoctoral Fellowships1.首都師范大學教育技術(shù)系北京1000372.中國科學院自動化研究所復雜系統(tǒng)與智能科學重點實驗室北京1000801.Department of Education Technology,Capital Normal Uni-versity,Beijing1000372.Key Laboratory of Complex Systems and Intelligence Sci

8、ence,Institute of Automation,CAS,Beijing 100080DOI:10.1360/aas-007-xxxx相對于其他成像技術(shù),如核磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI、計算機層析成像(Computed tomography,CT、超聲(Ultrasound、正電子發(fā)射斷層成像(Positron emission tomography,PET、單光子發(fā)射斷層成像(Single photon emission computed tomogra-phy,SPECT等,在體生物光學成像具有巨大的優(yōu)越性,堪稱是分子基因檢測領(lǐng)域的革命

9、性技術(shù).它具有如下優(yōu)點:較高的時間/空間分辨率;在腫瘤和良性/正常疾患之間有高的軟組織對比度;成像對比度直接與生物分子相關(guān),適于重要疾病的基因表達、生理過程的在體成像;獲得信息豐富、適于多參數(shù)復合測量;價格適中等.盡管其測量范圍與測量深度有限,但適用于小動物的整體在體成像和在體基因表達成像.表1和表2分別給出了幾種主要成像技術(shù)的應用場合及參數(shù)比較5,9,可以看出,基于分子光學標記的在體生物光學成像技術(shù)已經(jīng)在活體動物體內(nèi)基因表達規(guī)律方面展示了較大優(yōu)勢.近年來,隨著生物光學成像設(shè)備的研制以及轉(zhuǎn)基因動物的研究,國外發(fā)達國家已經(jīng)將在體生物光學成像技術(shù)廣泛應用于腫瘤免疫及治療、基因治療、藥物研發(fā)等領(lǐng)域,

10、取得了許多成果48.本文將分別介紹在體生物發(fā)光成像和在體熒光成像的特點、系統(tǒng)及主要應用,比較二者在分子探針、成像原理、光在生物組織中的傳輸模型和重建算法等方面的異同,綜述了在體生物光學成像技術(shù)的2自動化學報XX卷表1成像技術(shù)的主要應用Table1Primary uses of dierent imaging techniques成像方法主要應用核磁共振成像MRI表型、生理成像和細胞跟蹤的最好的全方位成像系統(tǒng)等計算機層析成像CT肺、骨癌成像等超聲成像血管和介入成像等正電子發(fā)射斷層成像PET分子代謝,如葡萄糖、胸腺嘧啶核苷等的成像等單光子發(fā)射斷層成像SPECT探針,如抗體、肽等的成像等熒光反射成像

11、FRI表面腫瘤分子事件的快速成像等熒光介導分子層析成像FMT對深部腫瘤靶向標記或熒光染料標記進行定量成像等生物發(fā)光成像BLI基因表達、細胞追蹤成像生物發(fā)光斷層成像BLT細胞、分子、基因水平的表達成像表2常用成像技術(shù)的參數(shù)比較Table2Parameters of imaging techniques成像方法空間分辨率時間分辨率測量深度造影劑價格MRI10-100m Min/hrs無限制釓,鏑和氧化鐵離子$CT50m Min無限制碘$超聲50m Min mm微型氣泡$PET1-2mm Min無限制18F,11C,15O$SPECT1-2mm Min無限制99mTc,111In(銦$熒光反射成像F

12、RI1-2mm Sec/min<1cm熒光蛋白,近紅外熒光染料$熒光介導分子層析成像FMT1-2mm Sec/min<10cm近紅外熒光染料$生物發(fā)光成像BLI mm Min cm熒光素$生物發(fā)光斷層成像BLT mm Min cm熒光素$其中:$表示價格<10萬美元;$表示價格在10-30萬美元之間;$表示價格>30萬美元基本原理和應用領(lǐng)域,討論了將在體生物光學成像應用于臨床的進一步發(fā)展方向.1在體生物發(fā)光成像1995年,Contag首次在活體哺乳動物體內(nèi)檢測到含Lux操縱子(由熒光素酶基因和其底物合成酶基因組成的病原菌,在不需要外源性底物的情況下,發(fā)出持續(xù)的可見光3.

13、1997年,他又觀察到表達Fluc基因的轉(zhuǎn)基因小鼠,注入底物熒光素(Luciferin后,熒光素酶蛋白與熒光素在氧、Mg2+離子存在的條件下消耗ATP發(fā)生氧化反應,將部分化學能轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姽饽茚尫?由于這種生物發(fā)光現(xiàn)象只有在活細胞內(nèi)才會發(fā)生,而且發(fā)光強度與標記細胞的數(shù)目成正比,因此已被廣泛應用于在體生物光學成像的研究中.熒光素酶的每個催化反應只產(chǎn)生一個光子,通常肉眼無法直接觀察到,而且光子在強散射性的生物組織中傳輸時,將會發(fā)生吸收、散射、反射、透射等大量光學行為10,11.因此,必須采用高靈敏度的光學檢測儀器(如CCD camera采集并定量檢測生物體內(nèi)所發(fā)射的光子數(shù)量,然后將其轉(zhuǎn)換成圖像.在體

14、生物發(fā)光成像中的發(fā)光光譜范圍通常為可見光到近紅外光波段,哺乳動物體內(nèi)血紅蛋白主要吸收可見光,水和脂質(zhì)主要吸收紅外線,但對波長為590nm1500nm的紅光至近紅外線吸收能力則較差.因此,大部分波長超過600nm的紅光,經(jīng)過散射、吸收后能夠穿透哺乳動物組織,被生物體外的高靈敏光學檢測儀器探測到,這是在體生物發(fā)光成像的理論基礎(chǔ).根據(jù)成像方式的不同,在體生物發(fā)光成像主要有BLI(Bioluminescent imag-ing和BLT(Bioluminescent tomography兩種.其中,BLI的輸出是二維圖像,即生物體外探測器上采集的光學信號.其原理簡單、使用方便快捷,適用于定性分析及簡單的

15、定量計算,但無法獲得生物體內(nèi)發(fā)光光源的深度信息,難以實現(xiàn)光源的準確定位11,12.目前,已有相應的產(chǎn)品問世,如精諾真公司(Xenogen Corp.的IVIS成像系統(tǒng)等.而BLT則X期尚書林等:自動化學報稿件加工樣本3利用多個生物體外探測器上采集的光學信號,根據(jù)斷層成像的原理,采用特定的反演算法1315(如:基于多層自適應有限元方法的BLT重建算法等,得到活體小動物體內(nèi)發(fā)光光源的精確位置信息.目前,BLT的光源定位和生物組織光學特性參數(shù)的反演問題已經(jīng)成為國內(nèi)外在體生物光學成像研究的重點和難點之一,但還僅限于實驗室研究階段,沒有達到臨床實驗的階段,所以尚未有成熟的成像系統(tǒng).典型的BLT原型系統(tǒng)是

16、由美國University of Iowa的Bioluminescence Tomography Labora-tory開發(fā)的1618.2在體熒光成像從20世紀80年代后期開始,一些研究者嘗試向生物體內(nèi)注射外源性的熒光染料作為對比劑,通過非侵入性或內(nèi)窺的光學測量手段,在腫瘤檢測中區(qū)分病態(tài)和正常組織.1994年,Chale等首次報道了GFP基因在大腸桿菌中的成功表達19.此后,作為一種理想的活體標記分子,GFP被迅速應用于各種生物學研究,特別是腫瘤學的研究20.目前,常用的熒光報告基團主要有綠色熒光蛋白(GFP和紅色熒光蛋白(DsRed等.在體熒光成像主要以熒光報告基團(如GFP、RFP等作為標

17、記物或?qū)Ρ葎?用特定波長的激發(fā)光激發(fā)熒光染料,使其吸收入射光產(chǎn)生能級躍遷,到達高能量狀態(tài),然后經(jīng)過特定的時間衰減回基態(tài),并發(fā)出波長長于入射光的發(fā)射光.同在體生物發(fā)光成像相似,紅光在哺乳動物體內(nèi)的穿透性比藍綠光要強得多,因此在體熒光成像中通常選擇紅光為激發(fā)光,得到近紅外波段的發(fā)射光.由于熒光蛋白本身對細胞無毒性,無種屬、組織和位置特異性,不需要任何反應底物及其它輔助因子,且檢測簡單,因此在體熒光成像已廣泛應用于腫瘤檢測和腦功能成像的研究中.根據(jù)成像方式的不同,在體熒光成像主要有FI(Fluorescence imaging和FMT(Fluorescence molecular tomograph

18、y兩種.其中,FI通常為平面或反射成像,生物體外探測器上采集的二維圖像是從活體動物體表射出的熒光信號的總和,它可以快速、便捷、遠距離、無損傷地獲得小動物的整體在體成像.代表性產(chǎn)品為Xenogen的IVIS成像系統(tǒng),可檢測波長400nm950nm的熒光.但成像深度往往受限(<5mm,難以獲得來自深層組織的更加精細和定量的信號.隨著對光和生物組織之間相互作用的研究,20世紀90年代后期出現(xiàn)了一種對生物組織光學特性參數(shù)(如吸收系數(shù)、散射系數(shù)等進行成像的近紅外光學散射斷層成像技術(shù),也稱為熒光介導分子層析成像(FMT.它能夠?qū)M織內(nèi)的熒光報告基團進行量化從而獲得高清晰度圖像,采用高靈敏度的體外探測

19、器對被測物體進行多點測量和采集.然后,根據(jù)光子在強散射性生物組織中的遷移規(guī)律和光傳播的數(shù)學模型,采用特定的反演算法,重建出生物組織內(nèi)部的熒光光學特性(組織的光學特性參數(shù)、熒光壽命、聚集度、量子產(chǎn)額等的分布圖像.熒光介導分子層析成像已在小動物模型上得到了有效驗證21,22,2002年Ntziachristos等用FMT開展了小鼠體內(nèi)組織蛋白酶B活性的影像研究23.隨著生物學的發(fā)展,在體熒光成像尤其是近紅外熒光成像能夠?qū)崿F(xiàn)分子水平的功能檢測,在基因表達圖譜、受體定位、蛋白質(zhì)功能研究、細胞通路的解釋和小分子蛋白之間相互作用的檢測等生物技術(shù)方面發(fā)揮了重要作用.除此之外,與其它成像方式相比,近紅外熒光成

20、像還具有以下優(yōu)點:探測系統(tǒng)簡單,成本較低;無電離輻射,染料穩(wěn)定,適合長期或頻率高的監(jiān)測;成像結(jié)果具有一定的定量性.在體熒光成像中,當熒光進入生物組織時,一部分被皮膚表面和生物體內(nèi)各器官表面反射,另一部分則被生物組織吸收和散射.因此,熒光報告基團越深,到達熒光報告基團的激發(fā)光信號越少,產(chǎn)生的發(fā)射光也就越少.目前,克服組織內(nèi)的吸收和散射是熒光報告基因的研究者所面臨的最大挑戰(zhàn).3在體生物發(fā)光成像與在體熒光成像的比較3.1分子探針在體生物發(fā)光成像和在體熒光成像的分子探針均為報告基因(Reporter gene.在體生物發(fā)光成像的分子探針主要為熒光素酶(Luciferase,分為兩類:一類為Firey

21、luciferase,底物為Luciferin,形成的產(chǎn)物為綠色;另一類為Renilla luciferase,底物為Coelenterazine,形成的產(chǎn)物為藍色.而在體熒光成像的分子探針主要為熒光蛋白,最常用的有綠色熒光蛋白(GFP和紅色熒光蛋白(DsRed.其中,綠色熒光蛋白是一類存在于水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白,當受到紫外或藍光激發(fā)時可自發(fā)地發(fā)射綠色熒光.因此,適合作為報告基因來研究基因表達、基因調(diào)控、細胞分化及蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的定位和轉(zhuǎn)運等.在體生物發(fā)光成像中,采用熒光素酶光學信號標記細胞,其顯著特點為:1體內(nèi)檢測的高靈敏度;2極低的背景噪聲,極高的信噪比;3由于熒

22、光素酶和底物的特異作用而發(fā)光,特異性極強;4單位細胞的發(fā)光數(shù)量很穩(wěn)定,分子標記物隨目標細胞的繁衍而增多,因此外部信號與動物體內(nèi)的目標細胞數(shù)成正比,不會隨細胞群體數(shù)目的增多而降低信號,可用于精確定量.因此,在體生物發(fā)光成像已經(jīng)成為研究活體動物體內(nèi)成像的最為有效的工具6,2428.Luciferase和GFP的在體光學成像29(表3表明:熒光素酶比綠色熒光蛋白更靈敏,4自動化學報XX卷但由于在體生物發(fā)光成像(BLI和BLT前,需對小動物注射熒光素酶底物,導致很難反復長時間成像,而且成像時間長,因此在不追求高靈敏度的情況下,可以選用在體熒光成像(FI和FMT.表3Luciferase和GFP的在體光

23、學成像比較Table3Comparison of in vivo optical imaging based on luciferase and GFP報告基因信噪比底物成像時間靈敏度特異性其他GFP低無Milliseconds(200-300ms低低無Luciferase高Luciferin Minute(10min高高需要與氧進行氧化反應產(chǎn)生光能與熒光素酶等報告基因相比,綠色熒光蛋白作為活體組織中的報道基因具有明顯優(yōu)勢:1細胞內(nèi)GFP的檢測僅僅需要激發(fā)光的激發(fā),不需要加入底物進行酶-底物反應;2GFP的表達與種屬無關(guān),無論細胞的種類和位置如何,都能在細胞內(nèi)自主表達,無需其他外源的輔助因子;

24、3GFP對細胞和組織是無毒的,不會擾亂細胞的正常生長和功能;4GFP能夠克服穿透、毒素、光漂白等不利因素.因此,它是在活體細胞中基因表達、蛋白質(zhì)定位和發(fā)育生物學研究的極其有用的工具.但當受到激發(fā)光激發(fā)時,生物體的皮膚、毛發(fā)和各種組織等會產(chǎn)生非特異性熒光,因此在體熒光成像具有較強的背景噪聲,其信噪比遠遠低于生物發(fā)光.而且,激發(fā)光需要穿過生物組織到達靶點,發(fā)射光再經(jīng)過吸收、散射等大量光學行為從生物體內(nèi)透射出來,被體外探測器接收,路徑較長,因此CCD探測到的信號水平取決于激發(fā)光的強度、發(fā)光細胞的數(shù)量、靶點的深度、生物組織的光學特性參數(shù)(如吸收系數(shù)、散射系數(shù)等多方面因素,使得熒光強度很難精確定量.3.

25、2成像原理及成像系統(tǒng)在體生物發(fā)光成像(BLI和BLT不需要外部光源激發(fā),自發(fā)熒光少;而在體熒光成像(FI和FMT需要特定波長的外部激發(fā)光源激發(fā),自發(fā)熒光較多,故前者比后者靈敏度更高,兩者的成像原理圖如圖1所示.University of Iowa的Bioluminescence Tomog-raphy Laboratory開發(fā)的在體生物發(fā)光斷層成像原型系統(tǒng),主要由CCD相機、固定小動物的支架、控制裝置(使支架水平運動、垂直運動或旋轉(zhuǎn)、完全密閉的不透光的成像暗箱等組成.將小動物麻醉后固定在支架上,并置于成像暗箱中,由控制裝置帶動支架沿水平方向運動、垂直方向運動或旋轉(zhuǎn),利用CCD相機從多個不同角度

26、和位置對活體小動物的生物發(fā)光現(xiàn)象進行投影成像.然后將采集到的數(shù)據(jù)信息傳輸?shù)接嬎銠C,并采用特定的圖像重建算法定位小動物體內(nèi)的發(fā)光光源,得到活體動物體內(nèi)發(fā)光光源的精確位置信息.Xenogen公司生產(chǎn)的IVIS成像系統(tǒng)是典型的在體熒光成像系統(tǒng),主要由CCD相機、成像暗箱、激光器、激發(fā)和發(fā)射濾光片、恒溫臺、氣體麻醉系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集的計算機、數(shù)據(jù)處理軟件(Living Imaging等組成.將小動物放置到成像暗箱中,利用高性能的制冷CCD對活體小動物某個特定位置的發(fā)光進行投影成像,探測從小動物體內(nèi)器官發(fā)射出的低水平熒光信號,然后將得到的投影圖像與小動物的普通圖像進行疊加,從而實現(xiàn)對小動物某個特定位置的生物

27、熒光進行量化,并且可以重復進行.由于在體熒光成像具有較強的背景噪聲,因此如何采用不同的技術(shù)、盡量降低背景信號、獲取準確的熒光信息、提高信噪比,就成為提高成像質(zhì)量的關(guān)鍵.目前,常用的方法主要有多譜段成像技術(shù)(Multi-spectral imaging和時域光學分子成像技術(shù)(Time domain optical imaging,TDOI.譜段分離技術(shù)通常用于信號出現(xiàn)疊加時分離微弱的靶信號,也用于多探針熒光標記.時域光學分子成像技術(shù)主要利用生物組織的強散射、低吸收特性,通過觀測發(fā)射光子從生物組織中通過的時間,將靶點信號與背景信號區(qū)分開,一般只用于動物的局部成像 .圖1在體生物光學成像的原理圖(a

28、在體熒光成像;b在體生物光學成像Fig.1Schematics of In Vivo Optical Imaging(aIn vivo uorescence imaging;bIn vivo bioluminescence imaging3.3近紅外熒光在強散射性生物組織中的傳播模型與重建算法實驗證明:大部分生物組織(如皮膚、腦組織X期尚書林等:自動化學報稿件加工樣本5等相對于近紅外熒光是高散射、低吸收的介質(zhì),生物組織對光子的作用包括散射、吸收等,光子在生物組織內(nèi)主要是前向傳播.因此,通常采用漫射方程(也稱擴散方程作為描述光子在強散射性生物組織中傳輸?shù)臄?shù)學模型,其時域的表達形式如下30,31:

29、·D(r(r,tµa(r(r,t=1c(r,ttS(r,t(1其中,(r,t是在點r處t時刻的平均漫射強度;µa(r是介質(zhì)的吸收系數(shù);c是光子在介質(zhì)中的傳輸速度;S(r,t是光源函數(shù);D(r是與位置相關(guān)的光子擴散系數(shù):D(r=13µa(r+µs(r(2µs(r=(1gµs(r是約化散射系數(shù),g是散射角余弦的平均值,µa(r是介質(zhì)的散射系數(shù).求解漫射方程的方法有解析法和數(shù)值法.由于漫射方程是一個偏微分方程,因此只有當生物組織模型和光源模型比較簡單時,才能獲得漫射方程的解析解.例如,當組織模型為均勻分布的無限大媒介、光

30、源模型為規(guī)則的幾何形狀(如球形面光源、球形體光源時,Cong等獲得了漫射方程的解析解32.但在一般情況下,尤其當介質(zhì)形狀不規(guī)則時,漫射方程的解析解通常很難獲得,因此一般采用數(shù)值解法或隨機統(tǒng)計解法求解漫射方程.漫射方程的數(shù)值解法主要有:有限差分法和有限元法;隨機統(tǒng)計解法主要有:Monte Carlo方法、隨機走動法等,這幾種方法各有其優(yōu)缺點33.其中,有限差分法是較早應用的方法,具有算法簡單、易于實現(xiàn)等優(yōu)點,但在處理不規(guī)則幾何形狀及各向異性媒介時比較困難.有限元方法可以有效處理復雜幾何形狀及各向異性分布的媒介,而且計算速度快,因此廣泛應用于光學成像的前向問題3437和逆向問題3841的求解中;但

31、是它最大的缺點是只能得到平均漫射強度(即漫射方程的解,無法得到其他中間物理量信息(如生物組織吸收光能量的分布圖等.Monte Carlo方法是一種基于”隨機數(shù)”的計算機隨機模擬方法,通過對大量光子包進行統(tǒng)計計算,得到求解區(qū)域內(nèi)任意位置處有意義的物理量信息11,12,其最大的優(yōu)點在于能夠處理復雜幾何形狀和非均勻分布的介質(zhì),其最大的缺點是計算量大,運行所需時間較長.根據(jù)重建目標的不同,在體生物光學成像的逆問題主要分為兩大類.第一,生物組織光學特性參數(shù)的重建.已知光源參數(shù)、生物組織的幾何參數(shù)和探測器上得到的投影數(shù)據(jù),求解生物組織內(nèi)部的光學特性參數(shù)(如吸收系數(shù)、散射系數(shù)等.第二,生物體內(nèi)熒光光源位置的

32、反演.已知生物組織的幾何參數(shù)、光學特性參數(shù)和探測器上得到的投影數(shù)據(jù),利用一定的先驗知識,定位小動物體內(nèi)熒光光源的精確位置.由于生物組織邊界處或CCD探測器上測量到的熒光散射光強是各邊界點的離散數(shù)值,數(shù)量有限,而待求解區(qū)域內(nèi)部的點往往數(shù)量巨大,所以這兩類逆問題均為非適定性問題,系統(tǒng)方程組是病態(tài)的,其解不唯一,對測量誤差及噪聲非常敏感.目前通常采用的重建算法大致分為基于擾動的算法(Perturbation based method4246、基于梯度的算法(Gradient based method41,4748和有限元方法等1315.其中,擾動法主要包括Born近似法、Rytov近似法和Newto

33、n法,已被廣泛應用于生物組織光學特性參數(shù)的重建4245和生物體內(nèi)熒光光源的定位.例如:Cong等根據(jù)BLT原型系統(tǒng)的CCD探測器測量得到的熒光信號,采用Born近似法,重建出小鼠體內(nèi)生物發(fā)光光源的位置信息46.梯度法則將求解的逆問題轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷€性優(yōu)化問題,通過構(gòu)造一個目標函數(shù)并使其最小化來獲取最優(yōu)解.Arridge等利用時域信號的拉普拉斯變換數(shù)據(jù)和共軛梯度法對圓形區(qū)域內(nèi)的吸收系數(shù)和散射系數(shù)進行重構(gòu)41,并比較了共軛梯度法(CGD、最速下降法(SD和代數(shù)重構(gòu)法(ART的重構(gòu)效果,指出CGD法的效果最好.在此基礎(chǔ)上,UCL的Biomedical Optical Re-search Group(BOR

34、G小組開發(fā)了時域光學重構(gòu)軟件TOAST(Time-resolved optical absorption and scattering tomography,對吸收系數(shù)和散射系數(shù)的空間分布進行重構(gòu).Hielscher等詳細比較了擾動法和梯度法的不同,采用時域數(shù)據(jù)和梯度法,獲得了散射系數(shù)和吸收系數(shù)的重建結(jié)果.在University of IOWA的Bioluminescent Tomography Lab設(shè)計開發(fā)的BLT原型系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,Cong等不僅采用有限元方法獲得了漫射方程的數(shù)值解,而且采用有限元法實現(xiàn)了熒光光源的反演15,取得了比較好的重建結(jié)果.中國科學院自動化研究所的呂玉杰等利用仿體實

35、驗數(shù)據(jù)和仿真數(shù)據(jù),實現(xiàn)了基于多層自適應有限元方法的熒光光源位置的重建,實驗證明了此重建算法具有良好的魯棒性和較高的效率13.雖然針對在體生物光學成像的兩類逆問題都取得了一定的研究成果,但重建算法仍存在一定局限性.第一,基于擾動的算法不僅對初始值的依賴性很大,而且需要不斷對系統(tǒng)的雅克比矩陣求逆,但雅克比矩陣一般是病態(tài)的,因此很難得到理想結(jié)果.第二,在實際仿真過程中,基于梯度的優(yōu)化算法往往在最初幾步下降速度較快,隨后收斂速度變慢,而且對距離邊界較近的位置變化敏感,因此對生物組織光學特性參數(shù)的重建精度不理想.如何減小初始值對重建結(jié)果的影響、提高算法的收斂速度和重建精度6 自 動 化 學 報 XX 卷

36、 是需要進一步探討的問題. 第三,基于有限元方法的 重建算法, 所采用的生物組織和熒光光源還僅限于 由規(guī)則幾何體組成的模型, 應用于真實小動物體內(nèi) 生物發(fā)光的重建還未見報道, 而且網(wǎng)格剖分的好壞 直接影響反演結(jié)果的精度, 導致生物體內(nèi)熒光光源 的定位誤差較大,因此有待于更深入的探索和研究. 4 在體生物光學成像的應用 作為一項新興的分子、基因表達的分析檢測技 術(shù), 在體生物光學成像已成功應用于生命科學、 生物 醫(yī)學、 分子生物學和藥物研發(fā)等領(lǐng)域, 取得了大量研 究成果, 主要包括：在體監(jiān)測腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移、基 因治療中的基因表達、機體的生理病理改變過程以 及進行藥物的篩選和評價等. 達54 .

37、 McCarey等將熒光素酶標記在靶基因上, 應 用siRNA及shRNA減弱了小鼠轉(zhuǎn)染的熒光素酶的表 達, 在活體動物體內(nèi)首次實時觀察到siRNA對特異 靶基因表達的阻斷作用55 . 以病毒56,57 (如腺病毒 及腺相關(guān)病毒等做載體, 將熒光素酶基因或綠色熒 光蛋白等作為報告基因加入載體, 采用在體生物光 學成像,能夠?qū)崟r觀察病毒在動物體內(nèi)的侵染活動, 獲取病毒侵染部位等相關(guān)信息. 4.3 揭示機體的生理病理改變過程 目前,在體生物光學成像技術(shù)已成功應用于干細 胞移植、腫瘤免疫、毒血癥、風濕性關(guān)節(jié)炎、皮炎 等發(fā)病機制的研究中, 可以實時監(jiān)測生物機體的生 理病理改變過程, 具有重要的臨床意義

38、. 應用轉(zhuǎn)基 因鼠,Wang等將熒光素酶基因轉(zhuǎn)導于人類造血干細 胞(HSC中, 并將其植入脾及骨髓, 利用在體生物光 學成像技術(shù), 揭示了HSC在小鼠骨髓腔中植活、 增殖 等動態(tài)信息, 實時監(jiān)測HSC的后代在小鼠體內(nèi)的生 長等58 . Kim等將熒光素酶基因轉(zhuǎn)染于神經(jīng)前體細 胞(NPC, 并注射入小鼠腦梗模型中, 在體生物光學 成像系統(tǒng)顯示神經(jīng)前體細胞迅速游走聚集至梗塞病 灶處59 . 風濕性關(guān)節(jié)炎和類風濕性關(guān)節(jié)炎的動物模 型研究表明：熒光報告基因在患關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)局部 產(chǎn)生熒光信號, 在健康組織周圍未見熒光信號,能夠 動態(tài)觀測關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展, 對關(guān)節(jié)炎疾病的治 療具有重要意義. 另外, 在

39、體生物光學成像技術(shù)在生 物大分子間相互作用及細胞凋亡的研究中也取得了 一定進展. Paulmurugan等將胰島素樣生長因子與 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白分別用GFP及Renilla熒 光素酶基因融合, 研究它們之間在活體小動物體內(nèi) 的相互作用60 . 4.1 在體監(jiān)測腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移 利用在體生物光學成像技術(shù),通過熒光素酶或綠 色熒光蛋白標記腫瘤細胞, 可以實時監(jiān)測被標記腫 瘤細胞在生物體內(nèi)生長、 轉(zhuǎn)移、 對藥物的反應等生理 和病理活動, 揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的細胞和分子機制. Contag20 等將熒光素酶和GFP作為報告基因,對腫 瘤細胞進行活體成像, 探討了使用報告基因在細胞 分子水平研究腫

40、瘤的前景, 并指出在體生物光學成 像技術(shù)具有較高的靈敏度, 尤其在監(jiān)測腫瘤細胞的 生長方面具有較大優(yōu)勢. Yang49,50 等首先利用光 學成像系統(tǒng)對表達GFP的腫瘤實現(xiàn)了實時非侵入 性成像, 記錄了腫瘤的轉(zhuǎn)移過程,開辟了在整體水平 上、無創(chuàng)、在體、實時跟蹤腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移 等生物學行為的嶄新領(lǐng)域. Jenkins等將標記了熒光 素酶基因的人類前列腺癌細胞注射到小鼠體內(nèi), 利 用在體生物光學成像系統(tǒng),實時、在體監(jiān)測了前列腺 癌細胞化療后的復發(fā)和轉(zhuǎn)移情況51 . 基于綠色熒光 蛋白的在體生物光學成像也在肺癌、大腸癌、前列 腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、腦膠質(zhì)瘤和乳腺癌等多 種腫瘤的生長轉(zhuǎn)移等研究

41、中得到了越來越廣泛的應 用49,50,52,53 . 4.4 藥物的篩選和評價 目前,轉(zhuǎn)基因動物模型已大量應用于病理研究、 藥物研發(fā)、藥物篩選和藥物評價等領(lǐng)域. 通過體外 基因轉(zhuǎn)染或直接注射等手段, 將熒光素酶或綠色熒 光蛋白等報告基因標記在生物體內(nèi)的任何細胞(如 腫瘤細胞、造血細胞等上, 采用在體生物光學成 像技術(shù)對其示蹤,了解細胞在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移規(guī)律, 不僅能夠檢測轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)的基因表達或內(nèi)源 性基因的活性和功能, 而且能夠?qū)λ幬锖Y選及療 效進行評價等. Zhang等利用轉(zhuǎn)基因鼠, 研究可誘 導的NO合成酶在急慢性免疫反應中的作用, 并以 此對多種化合物進行抗免疫反應的測試和篩選61 .

42、 肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳 腺癌、卵巢癌和腦癌的原位GFP腫瘤的整體熒光 成像模型已經(jīng)建立7 , 利用轉(zhuǎn)移鼠和血管鼠實現(xiàn)了 抗腫瘤生長轉(zhuǎn)移和血管生成的在體藥物篩選和評 價(. 基于GFP的在 4.2 在體監(jiān)測基因治療中的基因表達 隨著后基因組時代的到來和人們對疾病發(fā)生發(fā) 展機制的深入了解, 在基因水平上治療腫瘤、 心血管 疾病、 AIDS和分子遺傳病等惡性疾病已經(jīng)得到國內(nèi) 外研究人員越來越廣泛的關(guān)注. 如何客觀地檢測基 因治療的臨床療效判斷終點, 有效監(jiān)測轉(zhuǎn)基因在生 物體內(nèi)的傳送,并定量檢測基因治療的轉(zhuǎn)基因表達, 已經(jīng)成為基因治療應用的關(guān)鍵所在. 通過熒光素酶 或綠色熒光蛋

43、白等報告基因, 在體生物光學成像技 術(shù)能夠進行基因表達的準確定位和定量分析, 在整 體水平上無創(chuàng)、實時、定量地檢測轉(zhuǎn)基因的時空表 X期 尚書林等： 自動化學報 稿件加工樣本 7 體熒光成像揭示了腫瘤發(fā)生發(fā)展的細胞和分子機制, 非侵入性在體評價抗腫瘤藥物的療效20 . 5 Ntziachristos V, Ripoll J, Wang L V, Weissleder R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nature Biotechnology, 2005, 23(3: 3

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48、, 王革. 基于Monte Carlo方法的在體生物光學成像中 的光子傳輸模型. 軟件學報, 2004, 15(11: 17091719 13 Lv Y J, Tian J, Cong W X, Wang G, Luo J, Yang W, et al. A multilevel adaptive nite element algorithm for bioluminescence tomography. Optics Express, 2006, 14(18: 82118223 14 Jiang M, Wang G. Image reconstruction for bioluminesce

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51、Qian X, Cong W X, Shen H, Li Y, Han W M, et al. Recent development in bioluminescence tomography. Current Medical Imaging Reviews, 2006, 2(4: 453457 19 Chale M, Tu Y, Euskirchen G, Ward W W, Prasher D C. Green uorescent protein as a marker for gene expression. Science, 1994, 263(5148: 802805 20 Cont

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53、02, 1(2: 8288 22 Ntziachristos V, Tung C H, Bremer C, Weissleder R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nature Medicine, 2002, 8(7: 757760 5 展望 目前,在體生物光學成像還僅僅停留在仿體和小 動物實驗階段, 尚未進入臨床應用. 初步研究表明, 在體生物光學成像可達約10cm的測量深度7 , 近紅 外熒光能夠穿透12cm的乳腺或肺組織、6cm的肌肉 組織和5cm的成人腦組織62 , 因此在體

54、生物光學成 像具有巨大的臨床應用潛力, 但在許多方面仍需進 一步改進和完善. 第一,增強熒光團與背景間的對比度. 由于生物 組織(如皮膚、毛發(fā)等會產(chǎn)生非特異性熒光, 以及熒 光向周圍組織的泄漏等原因, 導致在體生物光學成 像具有較強的背景噪聲,信噪比較低, 熒光團與背景 組織間的對比度不足. 研究人員通過研制特異性分 子探針和熒光示蹤劑標記技術(shù), 使分子探針能夠比 較容易通過體內(nèi)環(huán)境障礙, 與靶分子進行特異性結(jié) 合；研究建立對特異性分子探針信號的放大和高靈 敏探測方法, 發(fā)展新的重建算法,降低背景噪聲,提高 在體生物光學成像的精度. 第二,重建算法的改進. 生物組織具有強散射、 低吸收特性,

55、因此熒光在生物組織中傳輸時將有吸 收、散射、反射、透射等多種光學行為, 導致在體生 物光學成像的逆問題是非適定性問題,其解不唯一, 對測量誤差及噪聲非常敏感. 在體生物光學成像重 建算法的研究, 尤其是生物體內(nèi)發(fā)光光源的反演,即 準確定位發(fā)光光源的位置, 已經(jīng)成為本領(lǐng)域亟待解 決的研究難點和熱點之一. 現(xiàn)有重建算法在重建的 精度、速度、靈敏度等方面均存在明顯不足, 極大地 限制了在體生物光學成像的實際應用. 第三,提高圖像分辨率. 在體生物光學成像系統(tǒng) 的分辨率遠遠低于傳統(tǒng)的X-ray斷層成像,大大減弱 了其實驗效果. 研究人員通過增加探測器的數(shù)目、 改 進現(xiàn)有成像系統(tǒng)、 抑制噪聲等多種手段,

56、 來進一步提 高圖像分辨率. References 1 Choy G, Choyke P, Libutti S K. Current advances in molecular imaging: noninvasive in vivo bioluminescent and uorescent optical imaging in cancer research. Molecular Imaging, 2003, 2(4: 303312 2 Contag C H, Fraser S, Weissleder R. Strategies in in vivo molecular imaging. N

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58、christos V. A submillimeter resolution uorescence molecular imaging system for small animal imaging. Medical Physics, 2003, 30(5: 901911 24 Minn A J, Gupta G P, Siegel P M, Bos P D, Shu W P, Dilip D G, et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature, 2005, 436(7050: 518524 25 Shachaf C M, Kopelman A M, Arvanitis C, Karlsson A, Beer S, Mandl S, et a1. MYC inactivation uncovers pluripotent dierentiation and tumour dormancy in hepatocelluar cancer. Nature, 2004, 431(7012: 11121117 26 Walenskv L D, Kung A L, Escher I, Malia T J, B